Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicles(쥐 모낭에서 기계적으로 자극된 구심성 출력과 신경 말단 라벨링의 결합 기록)

초록

출처: Bewick, G. et al., 마우스 모낭 피침 말단에서 기계적으로 자극된 구심성 출력 및 신경 말단 라벨링의 결합 기록. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 쥐귓바퀴의 모낭에서 기계적으로 자극된 구심성 출력과 신경 말단 라벨링의 결합된 기록을 보여줍니다. 형광성 염료에 노출되기 전과 후에 모낭 신경 말단의 기계적 자극, 생성된 활동 전위의 전기 생리학 기록, 모낭의 신경 말단 라벨링의 시각화와 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 전기생리학적 기록 설정

1. 가장자리 주위에 미세한 곤충 핀이 있는 PDMS 안감이 있는 기록 챔버의 바닥(귀 당 ~6-8개)을 마우스의 외이(귓바퀴) 피부에 고정하고, 귀 기저부의 청소된 신경을 두 개의 흡입 전극 근처에 놓습니다. 하나는 녹음용(신경을 채취하기 위함)이고 다른 하나는 무관심 전극(차등 증폭기에 중성 신호를 제공하기 위함)입니다.
2. 기록 전극의 경우, 개구부의 조리개와 내경을 두 신경의 결합된 두께에 조심스럽게 일치시켜 가능한 한 꼭 맞고 가능한 한 긴 길이로 맞도록 합니다.
3. 실리콘 고무 튜브가 있는 다른 쪽 끝에 부착된 2ml 주사기를 부드럽게 흡입하여 전극으로 신경을 끌어들입니다. 신경이 곧게 펴지고 접히거나 이중으로 늘어나지 않도록 합니다.
4. 더 강력한 흡입을 사용하여 결합 조직 또는 지방 조직을 끌어당겨 신경 주위의 구멍을 단단히 밀봉하는 플러그를 형성함으로써 높은 전기 저항/임피던스 맞춤을 개발합니다.
5. 필요한 경우 흡입으로 다른 (무관심한) 전극에 식염수를 채웁니다(모세관 작용으로 채울 수 있음).
6. 동일한 기록 와이어(은 또는 백금)를 기록 전극의 내부 구멍에 배치하여 염분과 신경(기록) 또는 전극의 좁고 불에 닦인 끝(무관심)에 접촉합니다. 각 전극은 2코어 차폐 케이블의 서로 다른 코어에 개별적으로 납땜됩니다. 수조(접지) 전극(Ag/AgCl 펠릿)을 수조에 넣고 기록 전극에 연결된 2심 케이블의 스크린에 접지합니다.
7. 두 전극의 전기 활동을 차동 증폭기의 별도 채널로 공급하고 필터(대역 통과 0.2-2kHz)하고 오실로스코프 화면에서 봅니다. 채널 A(녹음)와 채널 B(무관심) 전기 노이즈 레벨이 비슷한지 확인합니다. 이 단계에서는 두 전극이 균형을 이루기 전에 채널 A에서 정상적인 자발적 활동 전위를 볼 수 없을 수 있습니다.
8. 녹음(채널 A) 또는 무관심(채널 B) 전극의 임피던스를 증가시켜 전극 간의 배경 잡음 차이를 수정합니다. 유륜(지방) 결합 조직을 전극 중 하나로 더 빨아들이거나 50ml 주사기에 더 큰 흡입력을 가하여 이를 수행합니다.
   1. 이러한 방식으로 '균형'이 잡히면 다시 차동(A-B) 녹음으로 전환하고 트레이스에서 또는 귓바퀴 가장자리의 털을 쓰다듬을 때 자발적인 활동 전위(AP)를 찾습니다. 활동(스파이킹)이 보이지 않으면 기록 전극의 신경과 무관심한 전극의 유륜 결합 조직이 단단히 맞는지 다시 확인하십시오 – 일반적으로 밀봉이 더 단단하고(더 높은 저항) 두 전극의 임피던스가 더 같을수록 더 좋습니다. 연습을 통해 좋은 품질(>2:1)의 신호:잡음 비율을 얻을 수 있습니다.
9. 실험실 인터페이스와 컴퓨터에서 실행되는 전기생리학 소프트웨어를 통해 전기신경도를 기록합니다. 스파이크의 오디오 출력은 매우 유용하며 오디오 증폭기 및 관련 오디오 스피커를 통해 뉴로그램을 공급하여 달성할 수 있습니다. 임계값을 기준선 노이즈 바로 위에 있도록 조정합니다(백색 노이즈 '쉭쉭 소리'가 없는 것으로 식별됨).
10. 피침형 말단에 대한 약물 또는 형광 스티릴 염료의 접근을 증가시키려면 귓바퀴 가장자리 근처의 피하 지방층을 조심스럽게 벗겨내고 ~5mm x 5mm의 창을 열어 여포의 진피와 기저부를 노출시킵니다(그림 1A, B).
11. 선행 가장자리(해당되는 경우 방금 생성된 창 수준에서)에서 ~1mm의 지방이 제거된 귀 피부를 접어서 붙여진 피부층 사이에 투명한 식염수로 채워진 간격을 남겨둡니다. 피부에 닿지 않고 핀이나 접지된 미세한 집게로 접힌 가장자리를 따라 돌출된 털을 부드럽게 쓰다듬어 오실로스코프의 최대 AP 출력 영역과 오디오 출력에서 독특한 '딸깍' 및 '팝'을 찾습니다.

2. 자극 유발 활동 전위 기록

1. 세라믹 압전 액추에이터에 부착된 화염 연마 10cm 붕규산 미세 전극 유리인 기계적 자극 프로브를 배치하여 움직임이 피부 주름과 평행이 되도록 합니다. 끝을 피부 주름에서 약 0.5-1mm 떨어진 곳에 두어 피부가 아닌 털에 닿도록 합니다. 프로브 팁을 수동으로 천천히 움직여 머리카락을 빗나가게 하고 스파이크를 관찰/청취하여 효과적인 자극을 확인합니다.
2. 소프트웨어를 사용하여 1-3개의 모발에 대한 기계적 자극(예: 5Hz 정현파에서 3초, 10초마다 프로브 변위 200-500μm)을 구동하고 신경에서 자극 유발 반응을 기록합니다.
3. 10초 간격으로 여러 개의 동일한 기계적 자극 트레인을 제공합니다. 반복성을 위해 프로브 위치를 최적화한 다음 실험 프로토콜에 따라 자극 빈도를 줄입니다(예: 드롭 반복 속도를 10초에서 30초로).
4. 예를 들어, 고주파 노이즈 진폭의 ~2배와 가장 큰 AP의 ~25%로 설정된 간단한 임계값을 사용하여 소프트웨어를 사용하여 AP와 유사한 활동을 구별할 수 있습니다.
5. 임계값을 초과하는 AP를 '이벤트'로 계산하여 생성된 AP의 빈도와 특성을 정량화합니다.

3. N- (3- 트리에 틸 암모늄 프로필) -4- (4- (디 부틸 아미노) 스티릴) 피리디늄 디 브로 마이드 라벨링과 결합 된 자극 유발 발사 기록

1. 스티릴 염료가 자극 유발 구심성 발화 및 말단 라벨링에 미치는 영향을 조사하려면 선택한 스티릴 염료를 목욕 용액에 적절한 농도로 첨가하고 전기 기록을 계속합니다.
2. 필요한 노출 시간(보통 최소 30분) 후에 난포를 볼 준비를 합니다. 고정 핀을 제거하여 피부 플랩을 펼치고 깨끗해진 피부 부위를 노출시켜 말단 라벨을 드러냅니다.
3. 염료가 없는 식염수로 외부 염료를 씻어내고 식염수를 3번 완전히 변경합니다.
4. 10-15분 동안 가스가 첨가된 무염료 식염수의 최종 변화를 배양하여 가장 지속적인 염료 오염이 노출된/외부 멤브레인에서 침출될 수 있도록 합니다.
5. 식염수 내 격리제(설포부틸화 베타-사이클로덱스트린, 1mM, 5분)로 멤브레인에 남아 있는 내부화되지 않은 염료를 제거합니다.
6. 기록 챔버를 직립 에피 형광 현미경의 스테이지로 옮기고 챔버를 스테이지/슬라이드 이동 메커니즘과 결합시킵니다.
7. 스티릴 염료에 적합한 여기광으로 준비물을 비춥니다. 10X 또는 25X 형광 현미경 대물렌즈를 사용하여 여포 표지를 관찰합니다(그림 1).

결과

그림 1: 전기생리학적 기록 배열 및 N-(3-트리에틸암모늄프로필)-4-(4-(디부틸아미노) 스티릴) 피리디늄 디브로마이드 모낭 구심성 피침형 말단의 라벨링.(A) 귓바퀴 방향, 신경의 위치, 기록 전극 및 지방 조직 제거 후 노출된 여포 신경 분포 영역을 보여주는 전기생리학적 실험을 위해 설정된 귓바퀴 제제. (B) 여러 개의 모낭이 진피까지 위에 있는 지방 조직이 제거된 영역에서 명시야 조명에서 볼 수 있습니다. 어둡고 일반적으로 이중으로 된 모양은 피지선입니다. (C) 스티릴 염료 N-(3-트리에틸암모늄프로필)-4-(4-(디부틸아미노) 스티릴) 피리디늄 디브로마이드로 표지되고 상피형광 현미경에 의한 기계적 자극 후 이미지화된...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PDMS - 실가드 184	다우코닝		유연하고 불활성이며 반투명한 고체 실리콘 폴리머.
No. 3 뒤몽집게	정밀 과학 도구	11231-20
Austerlitz 곤충 핀	정밀 과학 도구	26002-10	최소한의 손상으로 귓바퀴 준비물을 PDMS에 단단히 부착할 수 있는 매우 가는 핀.
AC 차동 프리앰프	디지타이머	뉴로로그 NL104A	들어오는 구심성 전기신경도의 크기를 증폭합니다. 차동 기록은 외부 전기 잡음 및 베이스라인 드리프트를 최소화합니다.
고역 통과 / 저역 통과 필터	디지타이머	뉴로로그 NL125	최상의 신호 대 잡음비를 보장하기 위해 외부 전기 잡음을 줄임으로써 신호 조정.
스파이크 트리거	디지타이머	뉴로로그 NL201	이벤트 감지기 임계값을 설정하고 오실로스코프에 표시합니다. 이는 활동전위 검출 효능을 보여줍니다.
오디오 앰프 & 스피커	디지타이머	뉴로로그 NL120S	현미경 아래로 기계적 자극 준비를 조정하는 동안 감각 종말의 전기 발사 여부에 대한 유용한 오디오 모니터링
오실로스코프	디지타이머	PM3380A	우리는 이 구형 모델을 사용하지만 모든 표준 오실로스코프로 충분합니다.
피에조 전기 세라믹 웨이퍼	Morgan Electroceramics, 영국 사우샘프턴	PZT507	전기생리학/컴퓨터 인터페이스
피에조 전기 세라믹 전원 공급 장치	집에서 만든		0-200V DC 출력은 세라믹 웨이퍼 변위를 구동하며 기록/자극 소프트웨어 및 컴퓨터 인터페이스를 통한 출력의 가변 전자 제어. 우리는 Spike2 소프트웨어와 1401micro 컴퓨터 인터페이스를 사용합니다.
전기생리학 소프트웨어	캠브리지 전자 설계(CED)	스파이크2 v7	전기생리학 기록, 자극 및 데이터 분석 소프트웨어
실험실 인터페이스	캠브리지 전자 설계(CED)	1401 마이크로	증폭기/필터와 컴퓨터 사이의 전기생리학 인터페이스. 그것은 electroneurogram을 입력하고 또한 electroceramic 운동을 구동합니다.
FM1-43/시냅토그린 C4	바이오티움/케임브리지 바이오사이언스	BT70020	바깥쪽 소엽으로 가역적으로 분할하는 형광막 프로브. 주로 소포막 내포/외포작용(vesicle membrane endo-/exocytosis)을 모니터링하기 위해 사용됩니다.
아드바셉 7	바이오티움/케임브리지 바이오사이언스	BT70029	FM1-43 (및 기타 스티릴 피리디늄 염료)을 노출된 막에서 킬레이트화하는 설폰화 b-사이클로덱스트린 유도체로, 배경 라벨링/형광을 낮춤으로써 내재화된 염료를 더 명확하게 볼 수 있도록 합니다.
레티가 엑시 패스트 1394	큐이미징		흑백, 냉각 CCD 카메라 - 기본 모델
Volocity 3D 이미지 분석 소프트웨어	퍼킨 엘머	볼로시티 6.3	이미지 캡처 및 분석 소프트웨어.

년 년 시리즈 세포막의