초파리 중추신경계의 전기적 활동에 대한 세포외 기록

초록

출처: Swale, D. R., et al. Third-Instar Drosophila Melanogaster의 중추 신경계 활동의 전기 생리학적 기록. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 초파리 유충의 중추신경계(CNS)에서 신경 세포 활동을 세포 외로 기록하는 것을 보여줍니다. transection된 CNS는 기록 챔버에 배치되고 하행 신경의 전기 활동을 기록하여 기준선 발사 빈도를 설정합니다. 그런 다음 테스트 에이전트를 도입하고 발사 빈도의 변화를 기록하여 에이전트의 흥분 또는 억제 효과를 결정합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 유충 초파리 CNS를 해부하고 준비합니다.

참고: 유충 CNS 해부 방법은 Hafer와 Schedl에 명확하게 설명되어 있지만, 이전에 발표된 이러한 방법은 스파이크 빈도를 측정하는 데 중요한 하강 뉴런의 길이를 줄입니다. 여기에서는 길고 손상되지 않은 하행 뉴런을 유지하는 유충 CNS를 절제하기 위한 추가 방법이 요약되어 있습니다.

1. 식염수 제제.
   1. 해부 및 기록 식염수를 mM 단위로 준비합니다 : 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl₂, 4 2- [4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 일] 에탄 술폰산 (HEPES);pH를 7.25로 적정합니다.
2. 유충 Drosophila CNS를 해부합니다.
   1. 배양 바이알에서 떠돌이가 있는 제3의 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)를 식별 및 추출하고 200μL의 식염수에 넣습니다(그림 1A).
   2. 한 쌍의 가는 집게로 입 고리를 잡고 두 번째 집게로 구더기의 복부를 잡습니다(그림 1B).
      메모: 복부에 너무 많은 압력을 가하면 구더기의 얇은 표피층이 찢어질 수 있으므로 사용하지 마십시오.
   3. 입 고리와 복부를 다른 방향으로 부드럽게 당겨 구더기의 꼬리 끝과 머리 부분을 분리하고 구더기의 내장을 노출시킵니다(그림 1C).
      메모: CNS는 기관 및 소화관과 얽혀 있습니다. 하행 말초 신경이 절단되는 것을 방지하기 위해 조직에서 CNS를 절단하지 마십시오.
   4. 겸자로 소화관과 기관에서 CNS를 빼냅니다(그림 1D).
   5. 필요한 경우 Vannas 스프링 가위로 CNS 후방을 대뇌엽으로 수동으로 transection하여 혈액 뇌 장벽을 파괴합니다.
      메모: 이것은 사용되는 화학 물질의 물리 화학적 특성을 기반으로 수행되어야합니다. 그림 2A의 빨간색 선은 제안된 절편점과 그림 2B에 표시된 손상되지 않은 하행 말초 신경 줄기가 있는 전이된 CNS입니다. transection된 CNS는 1.2.5단계 완료 후 실험할 준비가 됩니다.

2. 초파리 중추신경계의 세포외 기록.

1. 녹음을 위해 CNS를 준비합니다.
   1. 붕규산 유리 모세관에서 유리 피펫 전극을 5-15mΩ의 저항으로 당깁니다.
   2. transsec된 CNS를 200μL의 식염수가 함유된 왁스 챔버에 삽입합니다. Clamp 접지선에 납땜된 악어 클립으로 코팅되지 않은 곤충 핀을 넣고 핀을 식염수에 삽입하여 회로를 완성합니다.
   3. 미세 조작기를 사용하여 전극을 transection된 CNS의 꼬리 끝으로 향하게 합니다. 말초 신경 줄기에 접촉하기 전에 획득/분석 소프트웨어에서 임계값 수준을 조정하여 배경 잡음 기록을 제거합니다.
   4. 주사기에 약간의 음의 압력을 가하여 편리한 말초 신경을 흡입 전극으로 끌어들입니다.
      메모: 기준선 발사 빈도는 전극으로 끌어당겨지는 뉴런의 수와 상관관계가 있으며, 뉴런이 많을수록 전극의 저항이 증가하는 경우가 많습니다.
2. CNS 하행 신경 활동의 세포 외 기록을 시작합니다.
   1. 데이터 수집 소프트웨어에서 기록을 시작하고 기준선 발사 주파수를 모니터링합니다. 기준 발사 속도 데이터를 수집하기 전에 5분 동안 발사 속도가 평형을 이루도록 합니다.
   2. 대조군 처리의 발사 패턴이 그림 3A.
      에 표시된 것과 유사한 파열 패턴이 아닌 경우 준비 및 기록을 폐기합니다. 메모: 변경된 발사 패턴은 신경 기능을 변경할 수 있는 중앙 패턴 생성기의 비정상적이거나 불안정한 활동을 암시합니다.
   3. 5분 후 200μL의 식염수 + 비히클을 추가하여 챔버의 총 부피를 400μL로 만들고 제어 발사 속도를 기록하기 시작합니다.
   4. 기준선이 설정된 후(3-5분), 식염수 200μL를 빼내고 식염수에 용해된 실험제 200μL를 추가합니다.
      메모: 디메틸설폭사이드(DMSO)는 친유성 화합물에 권장되는 용매이며 0.1% v/v를 초과해서는 안 됩니다.
   5. 약물 농도를 순차적으로 적용하고(낮은 농도에서 높은 농도로) 선택한 기간 동안 각 농도를 기록합니다(약물의 화학적 특성에 따라 조사자가 결정). 약물 및 최종 농도를 포함하는 설명을 포함하여 수집/분석 소프트웨어에서 약물 적용의 이 시점을 레이블로 지정합니다.
      메모: 절제 후 30-50분 후에는 중추신경계의 발화 활성이 약 10-20% 감소하므로 적절한 미처리 대조군을 수행해야 하며 약물 치료는 이 기간을 초과해서는 안 됩니다.

결과

그림 1: 제3-인스타 구더기에서 중추신경계(CNS)를 절제하는 방법. (가)200μL의 식염수에 온전한 구더기가 잠겼습니다. 화살표는 체벽을 분리하는 데 사용되는 입 고리를 나타냅니다. (B) 두 쌍의 집게를 구더기 중앙과 입 고리에 놓고 체벽을 분리하기 시작합니다. (C) 내장을 노출시키기 위해 약간의 지속적인 압력을 가하여 체벽을 분리합니다. (D)CNS는 명확하게 보이며(흰색 화살표) 때때로 내장과 얽혀 있습니다. 스케일 바는 패널 A, B, C, D에 대해 각각 1000μm, 750μm, 500μm 및 200μm를 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Drosophila melanogaster (균주 OR)	블루밍턴 초파리 주식 센터	2376
방진 테이블	키네틱 시스템	9200 시리즈
패러데이 케이지	키네틱 시스템	해당 사항 없음
붐에 대한 현미경 해부	니콘	SMZ800N	여러 스코프를 사용할 수 있습니다.붐 스탠드가 중요합니다.
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