Monitoring Seizure-Induced Neural Electrical Activity in Brain Slices Using Microelectrode Arrays(미세 전극 어레이를 사용한 뇌 절편에서 발작 유도 신경 전기 활동 모니터링)

초록

출처: Panuccio, G., et al. 미세 전극 어레이에 연결된 설치류 뇌 절편에서 간질 활동의 기록 및 조절. J. Vis. 특급 (2018년)

이 프로토콜은 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 발작 유도 약물에 노출된 뇌 절편의 전기 활동을 기록하는 것을 포함합니다. 이 절차에는 MEA 기록 챔버에 뇌 절편을 배치하고, 인공 발작을 유도하기 위해 전기 자극을 가하고, 결과 신호를 분석하는 것이 포함됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. MEA 설정 준비

참고: 녹음하기 15분 전에 시작하십시오.

1. 남은 4AP-ACSF(4-아미노피리딘 인공 뇌척수액)를 500mL 삼각 플라스크에 옮깁니다.
2. 삼각 플라스크를 MEA(Microelectrode arrays) 증폭기 위의 선반에 놓고 튜브를 사용하여 용액이 60mL 주사기를 지속적으로 공급할 수 있도록 합니다. 삼각 플라스크와 주사기의 높이를 조정하여 1mL/min.
   의 중력 공급 속도를 허용합니다. 메모: 올바른 높이는 튜빙 내경(ID)에 따라 다릅니다. ID가 5/32인치인 튜브의 경우 30cm면 충분합니다.
3. 삼각 플라스크와 주사기에서 95% O₂/5% CO₂ 가스 혼합물로 4AP-ACSF를 버블링하기 시작합니다.
4. 내부에 공기가 없을 때까지 4AP-ACSF가 관류 튜브를 통해 비커로 흐르도록 한 다음 용액 흐름을 중지합니다.
5. MEA 베이스의 발열체를 온도 조절기에 연결합니다. 건조 MEA 칩을 MEA 내부에 놓습니다 ampliifier 및 고정 amp리퍼 헤드. 플라스틱 파스퇴르 피펫은 4AP-ACSF를 기록 챔버의 입구 및 외부 저장소로 전달합니다.
6. 가열 캐뉼러를 마그네틱 홀더에 고정하고 팁을 기록 챔버 입구 포트 내부에 놓습니다. 마그네틱 홀더를 MEA의 마그네틱 스트립에 부착 amp리퍼 헤드. 관류 튜브를 캐뉼러에 연결합니다. 캐뉼러를 온도 조절기에 연결합니다.
   메모: 가열 캐뉼러는 기록 챔버 입구 포트에 도달하고 금속 재료로 인한 소음을 최소화하기 위해 비스듬한 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 튜브로 덮어야 합니다. 입구 저장소가 4AP-ACSF로 적절하게 채워지면 관류 시스템에서 떨어지는 방울이 보이지 않아야 합니다.
7. 흡입 바늘을 탱크 내부에 놓고 ACSF에 침수하여 음압이 있는지 확인하십시오. 일정한 저주파 흡입 소음이 발생하는지 확인하십시오.
   메모: 흡입 바늘은 4AP-ACSF가 뇌 절편 표면 바로 위에 흐르도록 배치해야 합니다. 진공 라인 또는 저소음 진공 펌프를 사용할 수 있습니다.
8. 1mL/분의 유속을 허용하도록 유량 조절기를 설정하고 관류를 시작합니다.
   메모: 중력 공급 관류는 연동 펌프로 인해 발생할 수 있는 소음을 제거합니다. 연동 펌프를 선호하는 경우 저소음 모델이 필수입니다.
9. 4AP-ACSF가 캐뉼러를 통해 흐르면 온도 조절기를 켭니다. 가열 캐뉼러를 37°C로 설정하고 MEA 베이스를 32°C로 설정하여 기록 챔버 내부의 온도를 32 - 34°C로 설정합니다.
   알림: 주의! 용액 없이 캐뉼러를 가열하지 마십시오. 그렇지 않으면 돌이킬 수 없게 손상될 수 있습니다. 캐뉼라의 온도를 기록 온도(즉, 32 - 34 °C)보다 높게 설정하여 가열 캐뉼러 끝과 기록 챔버 내의 설정 값과 실제 값 사이의 고유 온도 오프셋을 고려합니다. 기록 챔버의 유속, 환경 온도 및 부피는 모두 기록 용액의 온도에 영향을 미칩니다. 1.9단계에서 보고된 설정은 설명된 프로토콜 및 장비에 최적화되어 있습니다. 항상 열전대를 사용하여 실제 녹음 온도를 확인하고 필요에 따라 설정을 조정하십시오. 뇌 슬라이스가 과열되는 것을 방지하기 위해 MEA 베이스를 34°C 이상으로 가열하지 마십시오.
10. 외부 기준 전극을 레코딩 챔버 입구 저장소에 놓습니다.
    메모: MEA 칩에는 내부 기준 전극이 장착되어 있지만 맞춤형 기록 챔버가 이를 다룹니다. 따라서 외부 기준 전극을 사용해야 합니다. 포화 KCl(염화칼륨) 펠릿은 염소 처리 없이 바로 사용할 수 있기 때문에 가장 실용적입니다.

2. MEA 라이브 매핑

1. 4AP-ACSF 레벨과 기록 온도가 원하는 대로 안정화되면 관류와 흡입 마개를 꺼짐 위치로 돌려 일시적으로 중지합니다.
   1. 인버티드 글라스 파스퇴르 피펫을 사용하여 하나의 뇌 절편을 MEA 기록 챔버로 빠르게 옮깁니다. 필요에 따라 불에 광택이 나는 컬링 파스퇴르 피펫(그림 1C) 또는 부드럽고 컴팩트한 브러시를 사용하여 MEA 기록 영역의 위치를 조정합니다. 브레인 슬라이스에 홀드다운 앵커(그림 1D)를 놓습니다. 스톱콕을 다시 켜짐 위치로 돌려 관류와 흡입을 다시 시작합니다.
      참고: 위험! 절편을 옮겨야 하며 60초 이내에 관류를 다시 시작해야 하며, 그렇지 않으면 조직이 죽을 수 있습니다. 슬라이스 홀드다운 앵커는 표면 장력의 차이로 인해 뇌 슬라이스에 앵커를 놓는 동안 뇌 슬라이스가 움직이는 것을 방지하기 위해 4AP-ACSF에 유지해야 합니다. MEA에 뇌 절편을 고정하기 위한 앵커는 스테인리스강 와이어와 나일론 실(그림 1D)을 사용하여 맞춤 제작하거나 상용 출처에서 얻을 수 있습니다. 그림 1E는 MEA 칩을 앰프의 헤드에 연결한 최종 실험 설정을 보여줍니다: 레코딩 챔버 내의 MEA 칩에 있는 브레인 슬라이스는 맞춤형 앵커에 의해 고정됩니다. 기준 전극(빨간색 원)과 가열 캐뉼라를 덮고 있는 PTFE 튜브(빨간색 화살표)는 입구 저장소에 위치하고, 흡입 바늘(파란색 화살표)은 출구 저장소에 위치합니다.
2. 도립 현미경 스테이지에 장착된 카메라를 사용하여 뇌 절편의 사진을 촬영합니다.
3. 컴퓨터 소프트웨어에서 mapMEA 스크립트를 실행하여 전극을 매핑하는 GUI를 시작합니다.
   메모: 맞춤형 소프트웨어를 통해 사용자는 뇌 절편의 특정 구조에 해당하는 전극을 선택할 수 있습니다. 이 단계는 전기 자극을 사용하여 올바른 경로를 활성화하고 ictal 활동을 억제하는 데 중요합니다.
4. 찾아보기 버튼을 클릭하여 뇌 슬라이스의 사진을 로드합니다. 기준 전극이 MEA의 왼쪽 절반의 상단 행에 나타나는지 확인합니다(그림 2A, 삼각형 표시). Activate Pointer(포인터 활성화) 버튼을 클릭한 다음 어레이의 가장 왼쪽 행에서 상단 및 하단 전극을 선택하여 이미지 교정 및 전극 매핑을 위한 XY 좌표를 표시합니다.
5. 슬라이스 유형 드롭다운 메뉴에서 Horizontal을 선택합니다. 기본 구조 확인란을 선택합니다.
   메모: Enter New Structures 버튼을 선택하여 구조를 사용자 지정할 수 있습니다. 수평 브레인 슬라이스의 기본 구조는 그림 2A에 나와 있습니다.
6. 브레인 슬라이스 그림 아래에 있는 번호가 매겨진 푸시버튼을 사용하여 ROI에 해당하는 전극을 선택하고 구조 패널에서 해당 푸시버튼을 클릭하여 할당합니다(그림 2B). 각 ROI에 대해 이 단계를 반복합니다.
7. 저장 버튼을 누르면 소프트웨어가 선택한 전극 및 ROI를 보고하는 테이블이 포함된 #EXP_LabelledElectrodes이라는 결과 폴더를 생성합니다.

3. 간질 활동의 기록 및 전기 변조

1. 녹음하기 전에 뇌 절편이 녹음실 내에서 5 - 10분 동안 안정화되도록 합니다.
2. 자체 보정 및 안정화를 허용하기 위해 자극 프로토콜 최소 10분 전에 자극 장치를 켜십시오. 자극 제어 소프트웨어를 시작하고 자극기와 MEA 증폭기가 자극 제어 소프트웨어의 메인 패널에 있는 녹색 LED로 표시된 것처럼 올바르게 연결되어 있는지 확인합니다.
3. 바이폴라 구성에서 자극을 설정합니다. 스크립트 mapMEA로 매핑된 전극 쌍 중에서 CA1/근위 하부(cf.24,25)의 피라미드 세포층과 접촉하는 전극 쌍을 선택합니다(섹션 12 참조). 와이어를 사용하여 선택한 전극 중 하나를 자극기의 음극 플러그에 연결하고 다른 전극을 동일한 자극기 채널의 양극 플러그에 연결합니다. 다른 와이어를 사용하여 자극기의 접지를 증폭기의 접지에 연결하십시오.
4. 녹음 소프트웨어를 시작합니다. 데이터를 수집하려면 녹음 소프트웨어의 메인 패널에 있는 PLAY 버튼을 누르십시오. 최소 4개의 ictal 방전을 기록합니다.
   메모: 2kHz의 샘플링 주파수를 사용하면 하드 디스크 공간 사용을 최소화하면서 공정한 해상도로 전계자를 획득할 수 있습니다. 5분 분량의 녹음 파일은 ~80MB가 소요됩니다. 더 높은 샘플링 주파수가 필요할 수 있는데, 예를 들어, 자극 아티팩트 또는 다중 유닛 활동을 기록하기 위해 필요할 수 있습니다. 자기장 전위만 관찰하려면 300Hz에서 라이브 저역 통과 필터를 사용하여 다중 장치 활동을 차단하십시오.
5. 자극 강도를 결정합니다.
   1. 자극 제어 소프트웨어에서 메인 패널을 사용하여 100μs/phase.
      의 정사각형 biphasic positive-negative current pulse duration을 설계합니다. 알림: 주의! 직류 자극은 장비 손상을 방지하기 위해 균형 잡힌 충전 펄스가 필요합니다.
   2. 빠른 I/O(Input/Output) 테스트를 실행하여 최상의 자극 강도를 식별합니다. 3.5.1 단계에서 설계된 자극 펄스를 0.2 Hz 이하에서 전달하려면 5초 이상의 인터 펄스 간격을 자극 제어 소프트웨어의 적절한 형태로 추가합니다. 펄스 진폭 탭에서 100μA/위상의 초기 펄스 진폭을 입력하고 자극이 해마 주위 피질에서 간극과 유사한 이벤트를 안정적으로 유발할 수 있을 때까지 각 시도에서 50 - 100μA 단계씩 증가시킵니다(기록 소프트웨어에 의해 시각화된 신호 확인).
6. 변연계 ictogenesis의 전기적 조절
7. 관심 있는 자극 프로토콜을 전달하도록 자극 단위를 프로그래밍합니다. I/O 테스트 중에 식별된 자극 진폭을 사용합니다.
   메모: 유발 반응의 실패율은 ≤20%여야 합니다.
8. 자극이 멈춘 후, 최소 4회의 ictal 방전을 기록하여 네트워크가 자극 전 상태로 복구되는지 확인합니다(3.4단계 참조).

결과

그림 1: 이 프로토콜에 사용되는 맞춤형 장비. (A) 4AP에서 회수, 사전 예열 및 사전 배양을 위한 보관실은 비커와 페트리 접시를 사용하여 조립됩니다. 페트리 접시는 차단기보다 직경이 작아야 하며 주사기 플런저로 제자리에 고정됩니다. 페트리 접시의 바닥은 페트리 접시의 가장자리에 시아노아크릴레이트로 접착된 나일론 메쉬(부드러운 스타킹)로 대체됩니다. 산소는 페트리 접시의 벽과 비커 사이에 삽입된 구부러진 척추 바늘(22G)을 통해 공급됩니다. 거품은 비커 측면에서 나와야 하며 뇌 슬라이스 변위를 피하기 위해 나일론 메쉬에 닿지 않아야 합니다. 페트리 접시의 상단은 ACSF 증발을 방지하고 산소 포화도를 유지하기 위해 뚜껑으로 사용할 수 있습니다. (B) ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
폴리-D-라이신	시그마-애드리치	P7886	MEA 코팅에 필요
염화나트륨	시그마-애드리치	S9888	화학
케이클	시그마-애드리치	P9541	화학
KH2PO4	시그마-애드리치	795488	화학
CaCl2*2 H2O	시그마-애드리치	C3306 (영문	화학
D-포도당	시그마-애드리치	RDD016	화학
나HCO3	시그마-애드리치	S5761	화학
마그네슘Cl2*6 H2O	시그마-애드리치	M2670	화학
마그네슘SO4*6 H2O	시그마-애드리치	M5921	화학
자당	시그마-애드리치	RDD023	화학
피루브산, 98%	시그마-애드리치	107360	화학
4-아미노피리딘	시그마-애드리치	A78403	경련제
STG-2004	멀티채널 시스템	STG4004-1.6mA	전압(±8V) 및 전류 출력(±1.6mA)이 있는 4채널 자극 발생기
MEA1060	멀티채널 시스템	해당 사항 없음	MEA 증폭기
평면 MEA	멀티채널 시스템	60MEA500/30iR-Ti, 링 제외	사용자 지정 녹음실을 사용할 수 있도록 링이 없어야 합니다.
맥랙	멀티채널 시스템		레코딩 소프트웨어
맥스티멀러스 II	멀티채널 시스템		STG4004 제어 소프트웨어
TC02	멀티채널 시스템	TC02	2채널 온도 조절기
PH01	멀티채널 시스템	PH01	가열 관류 캐뉼라
시속 마일	멀티채널 시스템	시속 마일	PH01 및 흡입 바늘용 마그네틱 홀더
엘라스토스틸 E43	바커	43회	맞춤형 기록 챔버를 MEA에 장착하는 데 사용되는 엘라스토머 실란트
MEA 커스텀 챔버	크리셀 악기	SKE-챔버 MEA	맞춤형 녹음실
Ag/AgCl 전극, 펠릿, 1.0 mm	크리셀 악기	64-1309	맞춤형 녹음 챔버를 위한 참조 전극
테르가자임	시그마-애드리치	Z273287-1개	효소 세척제
MATLAB을	매쓰웍스		전극 매핑을 위한 프로그래밍 환경
VT1000S	라이카 바이오시스템즈	VT1000S	비브라톰
	워너 인스트루먼트	64-1309	Ag-AgCl 전극 펠릿 1.0mm(E205). 참조 전극.

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