후각 감각 뉴런의 광유전학적 자극에 반응하는 초파리 유충의 탐색 행동

초록

출처: Clark, D. A., et al. 후각 뉴런의 광유전학적 자극에 반응하여 초파리 유충 행동 추적. J. Vis. 특급. (2018).

이 비디오는 후각 감각 뉴런(ORN)의 광유전학적 자극에 대한 초파리 유충의 탐색 행동에 대한 연구를 보여줍니다. ORN에서 빛에 민감한 이온 채널을 발현하는 형질전환 초파리 유충은 행동 영역 내의 아가로스에 배치됩니다. 빛을 이용한 광유전학적 자극은 채널을 열어 양이온 유입을 일으켜 뇌로 신호 전달을 유발하고 탐색 행동이 기록됩니다.

프로토콜

1. 행동 경기장 구축 및 행동 경기장에서 광유전학적 자극을 가능하게 하는 하드웨어 준비

1. 빛이 부족한 행동 경기장을 구축하려면 검은색 플렉시 유리 아크릴 시트(두께 3mm)로 만든 89 x 61 x 66cm³(35" L x 24" W x 26" H) 치수의 상자를 구성합니다(재료 표 참조). 이러한 상자를 만들기 위한 재료는 지역 철물점에서 구할 수 있어야 합니다. 이 상자를 행동실의 탁자 위에 놓습니다(그림 1A).
2. 적외선(IR) 장역 통과 830nm 필터와 8mm F1.4 C 마운트 렌즈(재료 표 참조)가 장착된 흑백 USB(Universal Serial Bus) 3.0 CCD(Charge Coupled Device) 카메라를 블랙박스의 천장 중앙에 장착합니다. 어두운 경기장에서 유충을 비추기 위해 테이블 상단에 두 개의 적외선 발광 다이오드(LED) 스트립(재료 표 참조)을 놓습니다(그림 1A).
3. LED 플랫폼을 구축하려면 22cm × 22cm 정사각형 알루미늄 플레이트를 구하십시오(반사를 제거하기 위해 무광 블랙 마감 처리로 스프레이 페인팅하는 것이 좋음). 플레이트 중앙에서 금속 커터를 사용하여 CCD 카메라 주위에 들어갈 만큼 충분히 큰 구멍을 자릅니다.
4. 금속판을 빨간색 LED 스트립 조명으로 덮습니다(재료 표 참조). LED 조명 스트립을 직렬로 납땜하고 스트립 와이어를 Raspberry Pi 2B 마이크로프로세서(재료 표 참조)에 의해 제어되는 광 커플러 릴레이에 공급합니다(그림 1B 및 2).
5. 광커플러 릴레이를 LED 스트립에 연결하기 전에 Raspberry Pi 프로세서에 Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux 기반 운영 체제를 설치하고 구성합니다. LED 스트립과 광커플러에 전력을 공급하기 위한 전원 공급 장치를 연결합니다(그림 2)(자료표 참조). CCD 카메라 주변에 LED 플랫폼을 장착합니다(그림 1B).
   메모: Ubuntu Mate v16.04 운영 체제는 무료로 사용할 수 있습니다. 간단한 Python 기반 명령 세트는 LED 조명 자극의 프로그램 패턴에 쉽게 적용할 수 있습니다(구문 파일 참조).
6. 행동 경기장의 다양한 지점에서 균일한 방사 조도를 보장합니다. 분광계의 도움으로 경기장 표면의 절대 방사 조도를 측정하고 경기장 표면 전체에서 ~1.3 W/m²로 결정합니다.
   메모: 이 강도에서는 실험 과정에서 온도에 큰 변화가 관찰되지 않았습니다. 또 다른 연구에서는 ~1.9 W/^m2의 더 높은 방사 조도를 사용했으며 실험 과정에서 온도 변화가 관찰되지 않았습니다.

2. 행동 분석을 위한 초파리 유충 준비

1. 표준 플라이 푸드(재료 표 참조)에 대한 파리를 25°C, 50-60% 상대 습도(RH) 및 12시간/12시간의 라이트/다크 주기로 유지합니다.
2. 한 쌍의 ORN에서 CsChrimson을 발현하려면 UAS-IVS-CsChrimson 계통의 처녀 암컷을 OrX-Gal4 계통의 수컷으로 교차시킵니다('X'는 21쌍의 ORN 각각에서 고유하게 발현되는 21개의 유충 냄새 수용체(Or) 유전자 중 하나에 해당).
   1. 또는 21개의 유충 ORN 모두에서 CsChrimson을 발현하려면 UAS-IVS-CsChrimson 계통의 처녀 암컷을 Orco-Gal4 계통의 수컷으로 교차시킵니다('Orco'는 21개의 ORN 모두에서 발현되는 공동 수용체입니다).
   2. 이 실험에서는 UAS-IVS-CsChrimson 라인 자체를 컨트롤로 사용합니다.
      메모: 여기에 나열된 파리 주식은 모두 Bloomington Drosophila Stock Center에서 구할 수 있습니다(재료 표 참조).
3. 십자가에 있는 수컷과 암컷 파리가 48시간 동안 짝짓기를 하고 알을 낳을 수 있게 되면 성체를 새 유리병으로 옮깁니다.
   1. 계란이 들어있는 식품 바이알의 표면에 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해된 400μM 올 트랜스 망막(ATR)과 증류수에 용해된 89mM 자당을 포함하는 혼합물 400μL를 추가합니다.
      메모: 소량의 자당은 ATR 용액의 유충 먹이를 촉진합니다. ATR은 CsChrimson 발현의 상향 조절에 필요한 보조 인자입니다. ATR은 빛에 민감합니다.
   2. 달걀이 들어 있는 식품 바이알에 ATR을 넣으면 어둠 속에서 바이알을 추가로 72 h.
      동안 배양합니다. 참고: 이 연구와 위의 두 연구는 ATR 섭식으로 인한 유충 행동에 미치는 영향을 관찰하지 못했지만, ATR을 포함하지 않는 위의 혼합물과 동일한 양을 테스트 라인에 적용하여 ATR 섭식의 영향을 통제하는 것이 좋습니다.
4. 고밀도(15%) 자당 용액을 사용하여 파리 먹이 표면에서 세 번째 instar 유충(알을 낳은 후 ~120시간)을 추출합니다. P1000 마이크로피펫을 사용하여 자당 용액 표면에 떠 있는 유충을 1000mL 유리 비커로 분리합니다.
5. 유리 비커에 800mL의 신선한 증류수를 교환하여 유충을 3-4회 씻습니다. 유충이 행동 분석을 받기 전에 10분 동안 휴식을 취하도록 합니다.

3. 행동 분석

1. 행동실에서 일정한 온도(22–25°C 사이)와 습도(50 및 60% RH 사이)를 유지하십시오.
2. 22cm x 22cm 정사각형 페트리 접시에 녹인 아가로스 150mL(1.5%)를 부어 유충 크롤링 배지를 준비합니다. 분석의 각 시도에 대해 하나의 페트리 접시를 붓습니다(실험당 8-10번의 시도). 아가로스를 응고시키고 페트리 접시에서 1-2시간 동안 식힌 후 행동 분석에 사용하십시오.​
   1. 준비된 세 번째 인스타 유충 중 20마리 이하를 페트리 접시의 중앙으로 옮깁니다(그림 1C). 페트리 접시를 뚜껑으로 덮습니다. CCD 카메라 아래의 행동 경기장에 페트리 접시를 놓습니다.
      메모: 실험에 따라 행동 분석은 일반적으로 3-5분 동안 수행됩니다. 안내 신호를 제공하기 위해 분석에 냄새 물질을 사용하는 경우, 결과 냄새 구배가 약 5분 동안 안정적으로 유지되는 것이 관찰되었습니다. 더 긴 분석 시간은 권장되지 않습니다. 탈수로 인한 유충 또는 630nm 적색광 노출로 인한 유충에 대한 해로운 영향은 이 시점 내에서 관찰되지 않았습니다.
3. 850nm 적외선 LED 광원을 켜서 비디오에서 유충을 시각화합니다. CCD 카메라를 시작하여 애벌레의 움직임을 기록합니다.
4. Raspberry Pi 프로세서와 연결된 소프트웨어를 사용하여 적절한 패턴의 적색광 자극을 관리하는 절차를 프로그래밍합니다.
   메모: 간단한 Python 기반 명령 세트는 LED 조명 자극의 프로그램 패턴에 쉽게 적용할 수 있습니다(구문 파일 참조).

결과

그림 1: 행동 경기장 및 유충 크롤링 매체. (A) 블랙박스 행동 경기장의 정면 모습. 경기장의 열린 문에는 상자 천장에 매달려 있는 CCD 카메라가 드러납니다. (B) 광유전학적 자극에 사용되는 적색 LED 라이트 스트립이 포함된 금속 플랫폼의 바닥이 CCD 카메라 주변에 장착됩니다. (C) 분석에 사용된 유충 크롤링 매체의 평면도. 유충의 이동을 기록하기 전에, ~20마리의 씻겨진 유충이 1.5% 아가로스로 층을 이룬 22cm x 22cm 페트리 접시의 중심을 따라 놓입니다. 유충이 들어있는 페트리 접시는 CCD 카메라 아래 경기장 중앙과 카메라의 광원으로 사용되는 두 개의 적외선 LED 조명 스트립 사이에 배치됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
유충의 움직임을 포착하는 비디오 카메라
CCD 카메라	에드몬드 옵틱	106215
M52 - M55 필터 스레드 어댑터	에드몬드 옵틱	59-446
이미징 렌즈용 2" 사각 나사산 필터 홀더	에드몬드 옵틱	59-445
RG-715, 2" 제곱 롱패스 필터	에드몬드 옵틱	제46-066
광유전학 설정을 위한 전자 장치
라즈베리 파이 2B	RASPBERRY-PI.org	RPI2-MODB-V1.2
3채널 프로그래밍 가능한 전원 공급 장치	newegg.com	9SIA3C62037092
8채널 광커플러 릴레이	amazon.com	6454319
630nm 쿼드 행 LED 스트립 조명	environmentallights.com	레드3528-450-릴
850nm LED 스트립	environmentallights.com	wp-4000K-CC5050-60x2-kit
소프트웨어
우분투 메이트 v16.04	누분투	https://github.com/yslo/nubuntu
다른 상품들
플렉시글라스 블랙 아크릴	홈 디포	MC1184848BL
플라이 푸드 및 기타 시약
영양 파리 음식	제네시 사이언티픽	66-112
아가로스 파우더	제네시 사이언티픽	20-102
22cm x 22cm 사각 페트리 접시	폭스바겐 주식회사	25382-327
디엠소	시그마-알드리치	D2650
자당	시그마-알드리치	84097
모든 트랜스 망막	시그마-알드리치	R2500
파리
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또는42a-gal4	블루밍턴 초파리 주식 센터	9970
또는7a-gal4	블루밍턴 초파리 주식 센터	23907

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