$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 광유전학을 사용한 녹다운된 뉴런의 표적 자극에 의한 온전한 뉴런 회로에서 시냅스전 단백질의 역할 평가
참고: 다음 프로토콜은 급성 뇌 절편에서 전기생리학적 기록에 대한 이전 경험과 전기생리학적 설정에 대한 액세스가 필요합니다.
- 모자이크 혈청형 1 및 2(rAAV1/2)를 가진 재조합 아데노 관련 바이러스를 뇌에 정위 주사합니다. 마우스 또는 쥐의 뇌에 대한 정위 아틀라스를 사용하여 관심 뇌 영역에 대한 정위 좌표를 결정합니다.
- 마이크로피펫 풀러를 사용하여 Ø 7–9 μm의 긴 생크를 가진 주입 마이크로피펫을 당깁니다. 가위로 주입 마이크로피펫을 생크에 끼웁니다. 얇은 마커와 그래프 용지를 사용하여 주입 마이크로피펫에 2mm마다 교정 표시를 표시합니다.
- 동물을 이소플루란으로 마취하고 정위 장치에 고정합니다.
- 37°C로 설정된 가열 패드로 작업하는 동안 동물을 따뜻하게 유지하십시오.
- 안구 윤활제로 눈을 보호하십시오.
- 전기 면도기로 머리의 털을 면도하십시오.
- 면봉을 사용하여 면도한 머리에 포비돈 요오드를 펴 바릅니다.
- 해부 현미경으로 정중선을 절개합니다.
- 면봉으로 두개골 표면을 청소하여 브레그마와 람다가 보이도록 합니다.
- 주입 마이크로피펫을 홀더에 놓습니다. 홀더를 정위 암에 부착합니다.
- 브레그마 및/또는 람다를 기준으로 주입 부위의 x 및 y 좌표를 결정합니다.
- 드릴을 사용하여 대상 부위의 두개골을 얇게 만듭니다.
메모: 부드러운 원을 그리며 움직이고 두개골을 뚫는 것은 뇌 표면을 손상시킬 수 있으므로 피하십시오.
- 출혈이 있는 경우 수건 종이로 과도한 혈액을 흡수하십시오.
메모: 과도한 혈액은 z 좌표를 정확하게 결정하기 어렵게 만듭니다.
- 모세관 작용으로 ≤2 μL의 바이러스를 주입 마이크로피펫에 로드합니다.
- 주입 마이크로피펫을 주입 부위의 x 및 y 좌표로 가져옵니다.
- 경막에서 z 좌표를 계산하고 피펫을 천천히 뇌 속으로 내립니다.
- z 좌표에 도달하면 조직 조정을 위해 3분 동안 기다립니다.
- 유연한 튜브를 통해 주입 마이크로피펫 뒷면에 연결된 1mL 주사기를 사용하여 낮은 양압을 가합니다. 해부 현미경을 통해 주입 마이크로피펫에서 바이러스가 배출되는 속도를 육안으로 모니터링하고 보정 표시를 기준점으로 사용합니다.
메모: 조직 손상을 방지하기 위해 느린 속도(<100nL/분)로 바이러스를 주입해야 합니다.
- 주입이 완료되면 5분 동안 기다렸다가 주입 마이크로피펫을 0.2mm 빼고 5분 더 기다렸다가 바이러스의 역류를 방지합니다.
- 주사 마이크로피펫을 뇌에서 천천히 완전히 빼내어 표백제로 채워진 용기에 버립니다.
- 생리적으로 두개골을 적시고 3-4바늘로 피부를 봉합합니다.
- 상처에 겐타마이신 연고를 바릅니다.
- 동물이 완전히 회복될 때까지 음식 알갱이가 있는 깨끗한 우리와 열 램프 아래에 동물을 단독으로 수용합니다.
- ≥주사 후 15일 후, 깊은 이소플루란 마취 하에 동물의 목을 베십시오.
- 가스가 주입된(95% O2, 5% CO2) 얼음처럼 차가운 인공 뇌척수액(aCSF) 용액을 사용하여 진동으로 관심 뇌 영역의 급성 뇌 절편을 준비하며, (mM 단위): 123 NaCl, 1.25 KCl, 1.25 KH2PO4, 1.5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, 2 피루브산 나트륨 및 18 포도당(삼투압은 300 mOsm으로 조정됨). 예를 들어, CA3에서 CA1 피라미드 뉴런으로의 시냅스 전달을 분석하는 것이 목표인 경우 해마 형성(350μm 두께)의 시상 절편을 준비합니다.
메모: 이 단계부터는 환경광에 의한 광유전학적 프로브의 활성화를 피하기 위해 저조도 조건에서 작동합니다.
- 뇌 절편을 보관하도록 설계된 챔버에서 동일한 aCSF에서 37°C에서 30분 동안 절편을 회복시킵니다. 녹음할 때까지 실온에서 동일한 브레인 슬라이스 챔버에 슬라이스를 보관하십시오.
메모: 이러한 조건을 사용하면 슬라이스를 최대 6-8시간 동안 건강하게 유지할 수 있습니다.
- 한 슬라이스를 침수된 기록 챔버로 옮기고 1.5mM CaCl2(총 Ca2+: 2.5mM)가 보충되고 피루브산 나트륨이 없는 회수에 사용된 것과 동일한 aCSF 2mL/분으로 슈퍼퓨즈합니다.
메모: 절편은 독성을 최소화하기 위해 낮은 농도의 Ca2+(1mM)로 준비 및 유지됩니다. 녹음은 소포 방출을 위해 2.5mM Ca2+에서 수행됩니다.
- 발현된 형광 리포터의 신호를 간략하게 확인하십시오(예: 티디토마토; 그림 1B)를 사용하여 감염의 위치와 강도를 확인할 수 있습니다.
- 패치 전극을 다음을 포함하는 세포 내 용액으로 채웁니다(mM): 110 K-글루코네이트, 22 KCl, 5 NaCl, 0.5 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N,N'-테트라아세트산(EGTA), 3 MgCl2, 4 아데노신 5'-트리포스페이트 마그네슘 염(Mg-ATP), 0.5 구아노신 5'-트리포스페이트 트리소듐 염(Na3-GTP), 20 K2-크레아틴 인산염, 10 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 완충액 KOH(HEPES-KOH, pH 7.28, 290 mΩ).
메모: 피펫 저항이 5–6mΩ인 패치 전극을 사용하십시오.
- 적외선 조명 아래에서, 감염된 뉴런으로부터 시냅스 입력을 받는 뉴런으로부터 단단히 밀봉된 전체 세포 구성에 도달합니다. 예를 들어, CA3 피라미드 뉴런이 감염된 경우, CA1 영역의 근위부에서 내측에 있는 피라미드 뉴런을 패치합니다(그림 1C).
메모: 직렬 저항은 보상되지 않은 상태로 둘 수 있지만 일정하고 낮아야 합니다(≤20MΩ).
- 약리학을 사용하여 조사 중인 시냅스 전류를 분리합니다. 예를 들어, 흥분성 시냅스 전달을 조사하는 것이 목표인 경우 10μM 바이큐큘린으로 억제성 시냅스 전달을 차단합니다.
- 예를 들어, 감염된 뉴런의 소마타에 위치한 광섬유(Ø ≤250μm)에 연결된 473nm 블루 레이저를 사용하여 흥분성 시냅스후 전류(EPSC)와 같은 시냅스 전류를 유발합니다(예: CA3 피라미드 뉴런).
- 자극 길이를 최소로 조정하여 광 펄스당 두 개 이상의 활동 전위를 유발할 가능성을 줄입니다. ChETA를 사용하는 경우 2ms로 설정합니다.
- 레이저의 자극 강도를 조정하여 작지만 명확하게 감지할 수 있는 시냅스 전류(CA3와 CA1 피라미드 뉴런 사이에서 -70mV의 유지 전위에서 기록된 EPSC의 경우 ≤50pA 피크 진폭)를 생성합니다. 그림 1D). ChETA와 직경 250μm의 광섬유를 사용하는 경우 광섬유 출구에서 1-3mW의 자극 강도가 적합해야 합니다.
참고: 레이저 강도를 조절할 수 없는 경우 중성 밀도 필터를 사용하십시오.
- 473nm 레이저 광선을 감염된 뉴런의 소마타에 비추되 축삭돌기에는 비추지 마십시오. 예를 들어, CA3 소마타에 빛을 비추고 Schaffer 담보에서 멀리 떨어뜨려 축삭돌기의 직접적인 탈분극을 방지합니다.
- 나트륨 채널의 차단제인 테트로도톡신(TTX; 0.5μM)을 샘플에 적용하여 채널이 활동 전위에 의해 구동되는지 확인합니다.
- 다른 녹음에서 조사 중인 시냅스 전류에 선택적 차단제를 적용하여 자극이 선택적인지 확인합니다.
메모: 예를 들어, 2,3-다이옥소-6-니트로-7-설파모일-벤조[f]퀴녹살린(NBQX, 10μM)을 α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이옥사졸프로피온산(AMPA)형 글루타메이트 수용체 매개 EPSC에 적용합니다.
- 반복적인 자극(≤20Hz에서 ≥2 자극)에 대한 반응으로 동일한 급성 뇌 절편에서 광학 및 전기적으로 유발된 시냅스 전류를 비교합니다. 대조 microRNA(miR)를 사용할 때 전기 자극과 광학 자극 간에 유사한 정도의 시냅스 촉진 또는 억제가 관찰되어야 하며, 따라서 유사한 세포 메커니즘이 두 가지 유형의 자극에 의해 활성화됨을 시사합니다.
메모: 위의 단계는 광학 자극이 시냅스전 부톤의 직접적인 탈분극을 유도하지 않도록 하여 시냅스 전달의 일부 메커니즘을 우회하는 데 필요합니다.
