Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

초록

출처: Cameron, M. A., et al., 전기생리학 및 칼슘 이미징을 위한 급성 신경 조직의 장기간 배양. J. Vis. 특급. (120), (2017년)

이 비디오는 칼슘 이미징 및 전기 생리학적 기록을 사용하여 마우스 뇌 절편에서 신경 활동을 측정하는 기술을 보여줍니다. 이 방법은 조직에 칼륨 이온을 관류하고 고속 디지털 이미징을 통해 세포 내 칼슘 변화를 기록함으로써 실시간 신경 반응을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 칼슘 염료 로딩

1. 개별 연구자의 선호도에 따라 칼슘 염료를 선택합니다. 여기서는 Fluo-8AM 또는 Fluo-4AM을 사용합니다. 그러나, 이 방법은 다른 염료에도 적용될 수 있습니다: DMSO의 칼슘 염료를 1mM 용액 및 1% 블록 공중합체(예: 플루론산-127)에 용해시켜 최종 부피 50μL로 만들고 10분 동안 초음파 처리합니다.
2. 뇌 절편을 위한 최종 농도 10μM, 0.01% 블록 공중합체로 aCSF에 용액을 추가합니다.
   1. 성체 동물의 경우(>12주) 염료(50μL)를 뇌 절편에 직접 피펫으로 분사하고 염료가 깊은 층으로 더 잘 침투할 수 있도록 75분 동안 유지합니다.
   2. 염료 배양 중 침수된 슬라이스의 적절한 산소 공급을 보장하기 위해 2.5mL의 aCSF에 희석된 칼슘 염료로 뚜껑을 닫은 유리 로딩 챔버(직경 2.5cm, 높이 3.5cm의 원형 용기)를 준비합니다. 95% O₂/5% CO₂로 지속적으로 산소로 처리하십시오. 거품을 일으키지 마십시오.
3. 염료 로딩 후 조직을 CSF로 세척하고 배양 시스템으로 옮기고 실험적으로 사용할 준비가 될 때까지 온도를 15 - 16 °C로 천천히 낮춥니다.

2. 전기생리학적 기록 및 이미징

1. 조직을 수중 기록 챔버에 현미경으로 놓고 RT(~22°C) 또는 생리적 온도(~35°C)에서 4 - 5mL/분의 유속으로 산소화된 aCSF를 관류합니다. U자형 금색 또는 백금 와이어 조각을 가로질러 나일론이나 금실을 펴서 접착하여 만든 맞춤형 "하프"를 사용하여 티슈를 제자리에 고정합니다.
2. 전기생리학의 경우:
   1. 5-6 MΩ의 최종 저항을 달성하기 위해 마이크로피펫 풀러를 사용하여 1.5 mm(1.19 mm ID) 붕규산 유리에서 기록 피펫을 준비합니다.
   2. 파이펫에 3 - 4 μL의 내부 용액을 채우고 CCD 카메라를 사용하여 적외선 미분 간섭 대비(IR-DIC) 하에서 셀을 시각화합니다. 세포 내 솔루션은 실험 결과를 달성하기 위해 각 실험에 맞게 신중하게 조정되어야 합니다.
   3. micromanipulator를 사용하여 셀 멤브레인의 피펫 홀더에 있는 흡입구를 통해 가해지는 양압을 유지하면서 피펫을 배치합니다. ILM이 망막에서 제거되었기 때문에 사전에 막을 긁어낼 필요가 없습니다. 피펫이 셀에 장착되면 피펫에 부드러운 음압을 가하여 기가옴 밀봉을 달성합니다. 그런 다음 짧은 양의 음압으로 세포막을 파열합니다.
   4. 적절한 표준 기술을 사용하여 전체 셀 전류 또는 전압 클램프 기록을 만들 수 있습니다.
3. 칼슘 이미징:
   1. Fluo-4의 단일 여기 파장의 경우 460 - 490nm 대역통과 필터를 통해 여기광을 필터링하고 515 - 550nm 대역통과 필터를 통해 방출된 광을 필터링합니다. 가장 빠르고 민감한 녹화를 위해 고속 디지털 카메라를 사용하십시오. 필요에 따라 이미지를 획득합니다.
   2. 형광의 변화를 단일 파장(Fluo-4)에서 시간의 함수로 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소금	시그마 알드리치 VETEC	V800372
염화칼륨	시그마 알드리치	P9333
D-포도당	시그마 알드리치	G5767
중탄산나트륨	시그마 알드리치	S6014
인산나트륨 일염기성	시그마 알드리치	S2554
염화마그네슘	시그마 알드리치	M9272
염화칼슘	시그마 알드리치	223506
디메틸 설폭사이드 무수	시그마 알드리치	276855
Pluronic F-127 낮은 자외선 흡광도*	생명 기술	P-6867	DMSO의 20% 용액
플루오-4 AM	생명 기술	F23917
플루오-8 AM	아브캠	ab142773
고정식 스테이지 정립 현미경	올림푸스	BX51WI
현미경 대물렌즈	올림푸스	XLUMPlanFLN 20배/1.00W	20배
현미경 대물렌즈	올림푸스	LUMPlanFLN 60배/1.00w	60배
CCD 카메라	안도르	익손 +
패치 클램프 증폭기	분자 장치	멀티클램프 700B
데이터 수집 시스템	분자 장치	디지데이터 1440A	Axon Digidata® 시스템
붕규산 유리 모세관	셔터 계기 공동	BF150-86-10
미세 전극 풀러	셔터 계기 공동	P-97	화염/갈색 타입 마이크로 피펫 풀러
녹음/관류 챔버	워너 인스트루먼트	RC-40LP	로우 프로파일 개방형 배스 챔버
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