테트로도톡신 및 테트로도톡신 내성 나트륨 채널을 사용한 단시냅스 연결 테스트

초록

출처: Zhang, X. et al., 테트로도톡신 내성 나트륨 채널을 사용하여 초파리의 단시냅스 연결 검사. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 형질전환 플라이를 사용하여 단시냅스 연결을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 파리는 시냅스전 뉴런에 테트로도톡신 저항성 나트륨 채널과 적색광 활성화 채널을 가지고 있으며, 이는 시냅스후 뉴런으로 신호를 전달하기 위해 광유전학적으로 흥분되어 있습니다.

프로토콜

1. 파리 준비 및 GAL4 프로모터 라인 식별

1. GAL4 promoter line을 선택하고 UAS-NaChBac 전이유전자와 광유전학적 전이유전자를 모두 운반하는 파리와 교차하여 활성화합니다.
   메모: UAS-CsChrimson은 높은 전도도와 테트로도톡신(TTX) 내성 나트륨 채널(NaChBac) 매개 활동 전위를 쉽게 활성화하기 때문에 선택됩니다. UAS-NaChBac 및 UAS-CsChrimson은 모두 Bloomington Stocks Repository에서 사용할 수 있습니다.
2. all-trans retinal을 에탄올(35mM)의 원액으로 준비하고 -20°C의 냉동고에 보관합니다.
3. 이 스톡 28μL를 약 5mL의 재수화된 감자 플레이크 식품에 혼합하고 이 혼합물을 기존 초파리 배지의 바이알 상단에 추가합니다.
4. 1-3일 동안 0.2mM all-trans-retinal을 함유한 식품에 csChrimson을 발현하는 성충 파리를 키웁니다.

2. TTX 재고 준비

1. 증류수 또는 탈이온수에 1mM TTX의 원액을 만듭니다. 이 용액을 실험실 냉장고에 몇 달 동안 보관하십시오. 많은 기관에서 TTX를 유해 물질 또는 규제 물질로 분류하므로 TTX 보관에 관한 기관의 정책을 확인하십시오.

3. 전기생리학을 위한 파리 준비

1. all-trans-retinal이 있는 음식에서 자란 1-3일 된 성충 파리를 수집합니다.
2. 유리 섬광 유리병에 파리를 넣습니다. 유리병을 얼음 위에 1분 동안 올려 파리를 움직이지 못하게 합니다.
3. 거친 집게를 사용하여 맞춤형 녹음실에 파리를 삽입합니다. 챔버는 1/16" 아크릴로 절단된 3 1/2" 원형 레이저로 구성됩니다. 중앙에 3/4" 구멍을 자릅니다., 여기에 맞춤형 호일이 2액형 에폭시로 부착됩니다. 호일에는 파리가 삽입되는 삼각형 모양의 희망이 들어 있습니다.
4. 동물 주위에 왁스 또는 자외선(UV) 경화 에폭시를 도포하여 기록 챔버 내에 단단히 고정합니다.
5. 실체현미경으로 시각화할 수 있도록 구즈넥 광섬유로 준비물을 조명합니다. 구즈넥 파이버를 측면에서 직접 플라이를 비출 수 있도록 조정하여 비스듬한 조명을 위해 설정합니다.
6. 파리를 선명하게 시각화할 수 있도록 조명 수준을 가능한 가장 낮은 설정으로 조정합니다. 이 광도는 개별 실험에 따라 다릅니다.
   메모: 이 프로토콜은 현장 뇌 이식 방법을 사용하여 조정할 수 있습니다.
7. 외부 기록 식염수를 검색합니다. 식염수는 mM에 다음을 포함합니다 : 103 염화나트륨, NaCl, 3 염화칼륨, KCl, 5 N-tris (hydroxymethyl) methyl-2- aminoethane-sulfonic acid, 8 trehalose, 10 포도당, 26 중탄산 나트륨, NaHCO₃, 1 인산이 수소, NaH₂PO₄, 1.5 염화칼슘, CaCl₂ 및 4 염화마그네슘, MgCl₂ (270-275 mΩ로 조정). 식염수는 95% O₂/5% CO₂ (발암물질)로 거품이 일고 pH가 7.3으로 조정됩니다.
8. 플라이 제제 위에 세포외 기록 식염수 4-6방울을 떨어뜨립니다. 이 시점에서 더 나은 가시성을 위해 해부 현미경의 광 수준을 높입니다.
9. 전기 분해를 사용하여 텅스텐 와이어를 날카롭게합니다. 와이어를 만들려면 질산 칼륨 KNO₃의 포화 용액을 준비하고 약 20V의 교류 (AC)를 적용하면서 와이어 끝을 팁이 날카로워질 때까지 각각 100ms 동안 20회 용액에 담그십시오. 날카로운 텅스텐 와이어를 사용하여 파리 머리의 큐티클을 제거하여 뇌를 노출시킵니다.
10. 뇌를 둘러싸고 있는 기관과 지방체를 제거하여 뇌를 더욱 노출시킵니다. 더듬이 엽에 접근하는 경우 구부러진 텅스텐 와이어 또는 유사한 도구를 사용하여 호일 기록 챔버 아래에 더듬이를 부드럽게 밀어 넣어 가시성을 높입니다. 날카로운 집게를 사용하여 녹음할 관심 영역을 덮고 있는 신경교 외피를 부드럽게 찢습니다.
11. 레코딩 챔버를 전기생리학 리그로 옮깁니다. 뇌를 보존하기 위해 탄수화물로 거품을 일으킨 외부 기록 식염수로 즉시 관류를 시작하십시오. 식염수 저장고는 현미경 스테이지 위에 배치되고 준비물에 중력으로 공급됩니다. 진공 라인과 2L 삼각 플라스크를 사용하여 폐기물 식염수를 수집합니다.

4. 전체 세포 기록 얻기

1. 상업용 피펫 풀러에서 패치 피펫을 당깁니다. 팁 저항이 7mΩ에 가까운 적절한 파이펫을 얻기 위한 설정에 대해서는 설명서를 참조하십시오.
2. 4 μL의 내부 기록 용액을 패치 피펫에 추가합니다. 내부 식염수는 아스파르트산 칼륨 140개, N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES), 마그네슘 아데노신 삼인산(MgATP) 4개, 0.5 구아노신 5'-트리포스페이트 트리소듐 염 수화물(Na₃GTP), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA) 1개 및 염화칼륨(KCl) 1개(mM)로 구성됩니다.
3. 패치 cl 설정amp 전체 셀 녹음을 위한 liifier. 증폭기의 오프셋을 0으로 설정하고 테스트 펄스를 전달하도록 증폭기를 설정합니다. 여기에서는 AM 시스템 패치 클램프 증폭기 2,400이 사용됩니다.
4. 피펫을 통해 양압을 가하고 세포에 접근합니다. micromanipulator를 사용하여 피펫을 유도하고 세포에 접촉합니다. 양압을 해제합니다. 멤브레인의 유지 전위를 -60mV로 설정합니다. 피펫은 낮은 서브 피코암페어 유지 전류에 의해 입증된 바와 같이 세포의 멤브레인과 기가 옴 밀봉을 형성해야 합니다.
   메모: 녹색 형광 단백질(GFP) 유도 세포 표적화를 사용하는 경우 ChR2 활성화 및 잠재적인 시냅스 억제를 방지하기 위해 투피 형광등 사용을 최소화하십시오. 또한 5단계를 적용하기 전에 몇 분 동안 기다립니다.
5. -50 mV에서 -60 mV의 테스트 펄스를 전달하도록 증폭기를 설정합니다. 이 설정은 패치 클램프 증폭기의 표준입니다. 테스트 펄스는 패치 파이펫을 충전하는 데 필요한 전류를 나타내는 큰 용량성 과도 현상을 나타냅니다. AM 2400 또는 이와 유사한 증폭기의 용량 보상 손잡이를 조정하여 정전식 과도 현상을 제거합니다.
6. 세포막을 파열시키고 전체 세포 구성을 얻기 위해 음압의 짧은 펄스를 가합니다.
   메모: 전체 세포 구성은 뉴런의 커패시턴스를 보여주는 용량성 과도 현상이 크게 증가할 때 관찰됩니다. 유지 전류(기준선)의 약간의 증가도 관찰될 가능성이 있습니다. 설정 ampliifier를 현재 cl로 설정합니다.amp 모드를 선택하고 셀의 전위를 -50에서 -60mV로 조정합니다.

5. 시냅스 연결성 테스트

1. 발광 다이오드(LED) 드라이버를 트리거하여 광 펄스를 생성하도록 데이터 수집(DAQ) 시스템을 구성합니다. 여기서 내쇼날인스트루먼트의 DAQ 시스템은 Matlab과 함께 사용되어 아날로그 신호를 LED 드라이버에 전달합니다. LED 강도는 드라이버에 대한 아날로그 신호를 통해 조정됩니다. LED는 620-630nm 파장의 LED입니다.
2. 고출력 빨간색 LED를 준비제 바로 아래에 배치합니다. 0.238mW/mm²가 플라이에 도달하도록 광도를 조정합니다.
3. 관심 있는 시냅스후 세포에서 기록하는 동안 시냅스전 뉴런을 활성화합니다. 광유전학적으로, 약리학적으로 또는 신경 자극을 통해 세포 활성화를 달성합니다. 여기에 csChrimson과 짧은 적색 펄스가 적용됩니다.
   참고: 시냅스 연결은 전류 클램프에서 흥분성 시냅스후 전위(EPSP) 또는 전압 클램프에서 흥분성 시냅스후 전류(EPSC)로 모니터링할 수 있습니다. 40ms 광 펄스에 대한 응답으로 TTX를 적용하기 전에 시냅스 연결을 볼 수 있어야 합니다. 어떤 연결도 관찰되지 않는다면, 뉴런들이 단시냅스(mono-synaptically) 또는 다시냅스(polysynaptically)로 시냅스적으로 연결되어 있을 가능성은 거의 없다. 홀딩 포텐셜은 그에 따라 흥분성 또는 억제성 연결을 강조하도록 조정될 수 있습니다.
4. 생리식염수에서 연결이 관찰되면 관류 시스템에 TTX를 추가하여 최종 농도 1μM를 달성합니다. 재순환 펌프를 사용하여 식염수를 포획하고 재사용하여 TTX를 보존합니다. 연동 펌프는 수조에서 식염수를 끌어와 식염수 저장소로 되돌립니다.
5. 펌프의 속도를 조정하여 수조의 식염수 수치가 오르락내리락하지 않는 강력하고 일정한 진공을 제공하십시오.
   메모: TTX의 적용은 전체 세포에서 모니터링되고 있는 뉴런의 스파이크 활동을 중단시키는 결과를 가져와야 합니다. 이는 식염수에 충분한 TTX가 추가되었음을 확인합니다.
6. 짧은 적색 광 펄스(각 펄스에 대해 40ms)를 다시 적용합니다. 이 시점에서 남아 있는 모든 시냅스 연결은 단일 시냅스일 가능성이 높습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
UAS-cs크림슨	블루밍턴 초파리 주식 센터	55135	신경 활성제로 사용
UAS-NaChBac	블루밍턴 초파리 주식 센터	9466	TTX에서 세포의 Resotores 흥분성
테트로도톡신	토크리스	1078	TTX는 규제 물질이므로 구매 시 특별 허가가 필요할 수 있습니다
모든 트랜스 망막	시그마-알드리샬 트랜스-레티날	R2500	channelrhodopsin에 대한 보조 인자 필요
용접 가능한 321 스테인리스 강판, 0.002" 두께, 10" 너비	맥마스터 카	3254K7	맞춤형 플라이 홀더를 만드는 데 사용됩니다. 맞춤형 호일은 제공된 PDF 파일에서 pololu.com 레이저 절단할 수 있습니다.
해부 현미경	자이스	스테미 2000-C	제제의 해부에 사용
왁서	알모어	Eectra 왁서 66000	박리 중에 포일로 파리를 고정하는 데 사용됩니다
석랍	조앤	4917217	왁서와 함께 사용
숫자 5 겸자	정밀 과학 도구	#5CO	해부 및 외피에 사용
해부 가위	정밀 과학 도구	15001-08	절개 중 큐티클의 일부를 제거하는 데 사용됩니다
텅스텐 와이어	A-M 시스템	797500	해부를 위한 날카로운 바늘을 만들기 위해 전기분해와 함께 사용
왕복 연동 펌프	Simply Pumps(아마존)	미세먼지200S	재순환 TTX용
연동 펌프용 속도 컨트롤러	Zitrades (아마존)	해당 사항 없음	LED 조명 또는 리본용 PWM 디밍 컨트롤러, 12볼트 8암페어, 조정 가능한 밝기 조명 스위치 조광기 컨트롤러 DC12V 8A 96W led 스트립 라이트 B
Versa-Mount 정밀 압축 공기 레귤레이터	맥마스터 카	1804T1	패치 적용 중 양압 적용용
유리 모세혈관	세계적인 정밀 기기	TW150F-3	패치 피펫용
다목적 게이지	맥마스터 카	3846K431	압력 조절기용 게이지
전기생리학 카메라	다게 MTI	IR-1000	IR 범위(850nm)에서 작동하는 모든 카메라가 작동합니다. csChrimson을 활성화할 수 있으므로 빨간색 조명을 사용하고 싶지 않습니다
적외선 LED	쏘랩스	M850F2	비스듬한 조명용
IR LED를 위한 광섬유	쏘랩스	M89L01	IR LED에 커플
대물 렌즈	올림푸스 40X	럼플라플랜드	이것은 대부분의 microscipes에 사용할 수 있으며 파리 뉴런을 시각화하는 데 적합합니다.
황색 LED	쏘랩스	M590L3D	RFP 및 mCherry 시각화용
청색 LED	쏘랩스	M470L3D	GFP 시각화를 위해
GFP 필터 세트	크로마	49011	GFP 시각화 또는 channel2rhodopsin 자극
맞춤형 mCherry 필터 세트	크로마	ET580/25X 및 T600LPXR(49306 세트부터) ET610LP 배리어/방출 광학 장치 포함	식별된 뉴런에 channel2rhodopsin을 패치하려는 경우에만 사용하십시오
앰버와 블루 LED를 결합하는 다이크로익	쏘랩스	DMLP550R	mCherry 아래의 패치만 사용하고 블루라이트로 channel2rhodopsin을 흥분시킵니다.
적색 LED	LED공급	크리어 XPE 620 - 630 nm	csChrimson을 구동하는 데 사용됩니다.
LED 드라이버	LED공급	3021-D-E-1000	광유전학적 자극을 위한 LED를 구동하는 데 사용됩니다.
조작자	셔터 기기	MP-225	기록 중 피펫을 배치하는 데 사용됩니다.
패치클램프 앰프	A-M 시스템	모델 2400	등가 증폭기가 적합합니다.
베셀 필터	워너 인스트루먼트	LPF 202A	패치 적용 중에 오실로스코프에 대한 전류 트레이스를 필터링하는 데 사용되는 보조 필터입니다.
데이터 수집 시스템	내쇼날인스트루먼트	NI PCIe-6321 781044-01	증폭기에서 컴퓨터로 데이터를 기록하는 데 사용됩니다.
커넥터 블록 - BNC 단자 BNC-2090A	내쇼날인스트루먼트	779556-01	증폭기를 DAQ 카드에 연결하는 데 사용됩니다.
스틸 포일	맥마스터 카	3254K7	맞춤형 녹음실을 위한 강철 호일
자석	K&J 마그네틱스	D42	레코딩 챔버를 링 스탠드에 고정하려면
1/16" 셀 캐스트 아크릴 클리어	폴로루		맞춤형 녹음실을 만드는 데 사용됩니다. 아크릴은 제공된 PDF 파일에서 pololu.com 레이저 절단할 수 있습니다.