테트로도톡신 및 테트로도톡신 내성 나트륨 채널을 사용한 단시냅스 연결 테스트

초록

출처: Zhang, X. et al., 테트로도톡신 내성 나트륨 채널을 사용하여 초파리의 단시냅스 연결 검사. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 형질전환 플라이를 사용하여 단시냅스 연결을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 파리는 시냅스전 뉴런에 테트로도톡신 저항성 나트륨 채널과 적색광 활성화 채널을 가지고 있으며, 이는 시냅스후 뉴런으로 신호를 전달하기 위해 광유전학적으로 흥분되어 있습니다.

프로토콜

1. 파리 준비 및 GAL4 프로모터 라인 식별

1. GAL4 promoter line을 선택하고 UAS-NaChBac 전이유전자와 광유전학적 전이유전자를 모두 운반하는 파리와 교차하여 활성화합니다.
   메모: UAS-CsChrimson은 높은 전도도와 테트로도톡신(TTX) 내성 나트륨 채널(NaChBac) 매개 활동 전위를 쉽게 활성화하기 때문에 선택됩니다. UAS-NaChBac 및 UAS-CsChrimson은 모두 Bloomington Stocks Repository에서 사용할 수 있습니다.
2. all-trans retinal을 에탄올(35mM)의 원액으로 준비하고 -20°C의 냉동고에 보관합니다.
3. 이 스톡 28μL를 약 5mL의 재수화된 감자 플레이크 식품에 혼합하고 이 혼합물을 기존 초파리 배지의 바이알 상단에 추가합니다.
4. 1-3일 동안 0.2mM all-trans-retinal을 함유한 식품에 csChrimson을 발현하는 성충 파리를 키웁니다.

2. TTX 재고 준비

1. 증류수 또는 탈이온수에 1mM TTX의 원액을 만듭니....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
UAS-cs크림슨	블루밍턴 초파리 주식 센터	55135	신경 활성제로 사용
UAS-NaChBac	블루밍턴 초파리 주식 센터	9466	TTX에서 세포의 Resotores 흥분성
테트로도톡신	토크리스	1078	TTX는 규제 물질이므로 구매 시 특별 허가가 필요할 수 있습니다
모든 트랜스 망막	시그마-알드리샬 트랜스-레티날	R2500	channelrhodopsin에 대한 보조 인자 필요
용접 가능한 321 스테인리스 강판, 0.002" 두께, 10" 너비	맥마스터 카	3254K7	맞춤형 플라이 홀더를 만드는 데 사용됩니다. 맞춤형 호일은 제공된 PDF 파일에서 pololu.com 레이저 절단할 수 있습니다.
해부 현미경	자이스	스테미 2000-C	제제의 해부에 사용
왁서	알모어	Eectra 왁서 66000	박리 중에 포일로 파리를 고정하는 데 사용됩니다
석랍	조앤	4917217	왁서와 함께 사용
숫자 5 겸자	정밀 과학 도구	#5CO	해부 및 외피에 사용
해부 가위	정밀 과학 도구	15001-08	절개 중 큐티클의 일부를 제거하는 데 사용됩니다
텅스텐 와이어	A-M 시스템	797500	해부를 위한 날카로운 바늘을 만들기 위해 전기분해와 함께 사용
왕복 연동 펌프	Simply Pumps(아마존)	미세먼지200S	재순환 TTX용
연동 펌프용 속도 컨트롤러	Zitrades (아마존)	해당 사항 없음	LED 조명 또는 리본용 PWM 디밍 컨트롤러, 12볼트 8암페어, 조정 가능한 밝기 조명 스위치 조광기 컨트롤러 DC12V 8A 96W led 스트립 라이트 B
Versa-Mount 정밀 압축 공기 레귤레이터	맥마스터 카	1804T1	패치 적용 중 양압 적용용
유리 모세혈관	세계적인 정밀 기기	TW150F-3	패치 피펫용
다목적 게이지	맥마스터 카	3846K431	압력 조절기용 게이지
전기생리학 카메라	다게 MTI	IR-1000	IR 범위(850nm)에서 작동하는 모든 카메라가 작동합니다. csChrimson을 활성화할 수 있으므로 빨간색 조명을 사용하고 싶지 않습니다
적외선 LED	쏘랩스	M850F2	비스듬한 조명용
IR LED를 위한 광섬유	쏘랩스	M89L01	IR LED에 커플
대물 렌즈	올림푸스 40X	럼플라플랜드	이것은 대부분의 microscipes에 사용할 수 있으며 파리 뉴런을 시각화하는 데 적합합니다.
황색 LED	쏘랩스	M590L3D	RFP 및 mCherry 시각화용
청색 LED	쏘랩스	M470L3D	GFP 시각화를 위해
GFP 필터 세트	크로마	49011	GFP 시각화 또는 channel2rhodopsin 자극
맞춤형 mCherry 필터 세트	크로마	ET580/25X 및 T600LPXR(49306 세트부터) ET610LP 배리어/방출 광학 장치 포함	식별된 뉴런에 channel2rhodopsin을 패치하려는 경우에만 사용하십시오
앰버와 블루 LED를 결합하는 다이크로익	쏘랩스	DMLP550R	mCherry 아래의 패치만 사용하고 블루라이트로 channel2rhodopsin을 흥분시킵니다.
적색 LED	LED공급	크리어 XPE 620 - 630 nm	csChrimson을 구동하는 데 사용됩니다.
LED 드라이버	LED공급	3021-D-E-1000	광유전학적 자극을 위한 LED를 구동하는 데 사용됩니다.
조작자	셔터 기기	MP-225	기록 중 피펫을 배치하는 데 사용됩니다.
패치클램프 앰프	A-M 시스템	모델 2400	등가 증폭기가 적합합니다.
베셀 필터	워너 인스트루먼트	LPF 202A	패치 적용 중에 오실로스코프에 대한 전류 트레이스를 필터링하는 데 사용되는 보조 필터입니다.
데이터 수집 시스템	내쇼날인스트루먼트	NI PCIe-6321 781044-01	증폭기에서 컴퓨터로 데이터를 기록하는 데 사용됩니다.
커넥터 블록 - BNC 단자 BNC-2090A	내쇼날인스트루먼트	779556-01	증폭기를 DAQ 카드에 연결하는 데 사용됩니다.
스틸 포일	맥마스터 카	3254K7	맞춤형 녹음실을 위한 강철 호일
자석	K&J 마그네틱스	D42	레코딩 챔버를 링 스탠드에 고정하려면
1/16" 셀 캐스트 아크릴 클리어	폴로루		맞춤형 녹음실을 만드는 데 사용됩니다. 아크릴은 제공된 PDF 파일에서 pololu.com 레이저 절단할 수 있습니다.

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