실시간 발작 감지를 위해 쥐 모델에 머리 전극 시스템 이식

초록

출처: Kozák, G., et al. 쥐의 만성 경두개 전기 자극 및 피질 내 기록. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 실시간 발작 감지를 위해 마취된 쥐에 머리 전극 시스템을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 절차에는 자극 및 전극 기록, 치과용 시멘트로 고정, 헤드 마운트 증폭기에 연결하는 작업이 포함됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 자극 전극의 제작

1. 하나의 자극 전극을 만들려면 10cm 길이의 소형 연결 와이어 6개를 자르고 한쪽 끝에서 2cm, 다른 쪽 끝에서 1cm의 클래딩을 제거합니다.
2. 두 개의 케이블을 함께 꼬아서 짧게 벗겨진 쪽에 납땜합니다.
3. SOT-353(Small Outline Transistor-353) 케이스로 모든 집적 회로의 3테이프 패키징 스트립을 확보하십시오.
4. 패키지의 세 개의 구멍을 통해 꼬인 전선을 꿰매십시오. 와이어의 더 긴 벗겨진 부분은 패키지의 캐비티에 있어야 합니다. 절연체의 끝이 구멍의 가장자리와 일직선이 되도록 케이블을 배치합니다.
5. 구멍에 치과 시멘트를 넣어 전선을 고정하십시오.
   주의: 치과용 시멘트는 패키지의 공동으로 누출되지 않도록 충분히 밀도가 높아야 합니다.
6. 시멘트가 응고되면(최소 10분) 패키지를 뒤집고 구멍에 얇은 초강력 접착제 층을 넣어 다공성 시멘트를 향한 방수 밀봉을 형성합니다. 벗겨진 전선을 붙이지 마십시오.
7. 벗겨진 짧은면에서 케이블을 함께 꼬아서 납땜합니다 (그림 1A).
8. 가는 핀셋 끝으로 전선의 길게 벗겨진 부분을 잡고 굴린 다음 구멍에 감쌉니다(그림 1B). 필요한 경우 여분의 케이블을 자릅니다.

2. 기록 전극의 제작

1. 하나의 기록 삼중항 전극(그림 1C-D)을 만들려면 고속 회전톱을 사용하여 1cm 길이의 스테인리스 스틸 튜브 조각을 절단합니다. 날카로운 바늘로 튜브 끝에서 핀을 제거하고 튜브에 이물질이 없고 완전히 투과되는지 확인합니다.
   메모: 펜치는 튜브를 뒤틀릴 수 있으므로 사용하지 마십시오.
2. 최소 3cm 길이의 금도금 보드 스페이서 핀을 구부려 J자형 홀더를 만듭니다. 'J'자형의 긴 다리를 자르고 함께 납땜하여 원래 모양을 되돌려 입체 장치에 의해 고정될 긴 선형 부분과 전극을 고정하고 앵커링 포인트 역할을 할 'U' 모양 사이에 분리 가능한 조인트를 만듭니다. 튜브와 'J' 홀더의 짧은 다리를 함께 붙입니다. 안정성을 위해 필요한 경우 1cm 길이의 막대를 추가로 붙입니다.
3. 2.5cm 길이의 전극선 3개를 스테인리스 초극세 가위로 자릅니다. 절단이 명확하고 날카로우며 전극선의 원형 표면에서 절연이 손상되지 않았는지 확인하십시오. 또한 가해진 힘으로 인해 절단 팁이 구부러지지 않았는지 확인하십시오. 각 전선의 한쪽 끝을 다른 각도(예: 왼쪽 직선 하나, 45° 직선 하나, 직각 하나)로 1mm 또는 2mm 구부려 구별할 수 있도록 합니다.
4. 튜브에 전선을 채웁니다. 실험을 위한 전극의 적절한 간격을 선택합니다(예: 피질 국소 전위(LFP) 및 전류 소스 밀도(CSD) 등록의 경우 튜브 개구부에서 와이어 팁의 권장 돌출부는 각각 4.5mm, 4.1mm 및 3.7mm입니다). 적절한 채널 순서를 유지하기 위해 어떤 와이어가 어떤 깊이에 해당하는지 확인하십시오.
5. 와이어가 서로 바로 옆에 정렬되고 튜브와 평행이 되면 전극 와이어를 고정하기 위해 날카로운 바늘로 튜브의 양쪽 끝에 액체 초접착제 한 방울을 떨어뜨립니다. 모세관 효과로 인해 접착제가 튜브 안으로 흘러 들어가지만 돌출된 끝의 기록 부위를 향하지 않는지 확인하십시오.
6. 사용할 녹음 시스템과 호환되는 적절한 마이크로 커넥터가 있는 전극 인터페이스 보드를 준비합니다.
7. 녹음되지 않고 구부러진 전선 끝을 원하는 녹음 채널에 해당하는 전극 인터페이스 보드의 구멍에 삽입합니다. 모든 전선이 제자리에 있으면 핀셋으로 금색 핀을 구멍에 밀어 넣습니다.
   메모: 금핀은 치과용 시멘트를 사용하여 제자리에 고정할 수 있지만 대부분의 경우 이러한 안전 단계 없이도 충분히 안정적입니다.

3. 마취

1. 동물을 밀폐된 마취 유도실에 넣고 2 L/min 의료용 공기에 4 - 5%의 이소플루란을 채웁니다.
2. 쥐가 누워있을 때, 챔버에서 동물을 꺼내고 적절한 환기 노즈 피스가있는 입체 프레임에 놓습니다.
3. 이소플루란 수준을 2%로 설정하되 공기 흐름 속도는 동일하게 유지되어야 합니다. 마취 수준을 확인하십시오. 꼬집음에 대한 반응으로 발 철수 반사가 없으면 계속하고, 그렇지 않으면 마취 깊이를 높입니다.
4. 동종 모니터링 시스템으로 쥐의 체온을 37 ± 0.5 ° C로 모니터링하고 유지하십시오. 각막의 건조를 방지하기 위해 파라핀 연고 한 방울을 눈에 바르십시오. 필요한 경우 수술 중에 이 절차를 여러 번 반복합니다.
5. 기도에 점액이 형성되는 것을 방지하기 위해 0.3mg/kg의 아트로핀을 피하주사합니다. 더 긴 수술의 경우 4시간마다 이 작업을 반복하십시오. 호흡을 모니터링하고 필요한 경우 기화기를 조정하십시오.

4. 자극 및 기록 전극의 이식

참고: 필요한 모든 수술 기구를 고압멸균하고 전체 절차 동안 무균 및 방부제의 일반 규칙을 주의 깊게 따르십시오. 수술 부위 외부의 멸균되지 않은 부위를 만지지 마십시오. 이식하기 전에 전극을 에틸 알코올(70%)에 30분 동안 담그십시오.

1. 이발기로 두피의 털 대부분을 제거합니다. 두피에 제모 크림을 바르고 표면에 골고루 펴 바른 다음 몇 분 정도 기다립니다. 주걱을 사용하여 크림과 남은 머리카락을 부드럽게 제거합니다. 물로 피부를 헹구고 소독제로 헹굽니다.
2. 1 - 2% 리도카인(총 용량 7mg/kg을 초과하지 않음)을 피하주사하여 피부를 마비시킵니다. 눈에 수의사 연고 한 방울을 바르십시오(예: 파라핀).
3. 이마에서 목까지 메스로 정중선을 꼼꼼하고 긴(~2cm) 시상 절개를 합니다. 두개골에서 골막을 포함한 조직을 해부합니다. 그런 다음 끌이나 치아 핀셋을 사용하여 두 측두골의 크리스테 사이의 영역을 청소합니다. 두개골이 노출된 상태를 유지하기 위해 4마리의 불독을 사용하여 절개된 피부를 집어넣습니다.
4. 측두골의 가파른 가장자리와 근육 사이에 가는 핀셋을 부드럽게 놓고 분리합니다. 근육을 손상시키지 않고 측두골의 넓은 표면을 가능한 한 많이 노출시키기 위해, 가급적이면 후두골의 가장자리에서 관상 봉합사의 평면까지 지깅 동작을 합니다.
5. 측두골이 노출되지 않도록 견인기를 bitemporally로 배치합니다.
6. 두개골 표면을 1 - 2 mL 3 % 과산화수소 (H₂O_{2 )}로 헹군 다음 1 - 2 mL의 물로 씻으십시오.
7. 측두골 표면을 매우 조심스럽게 자연 건조하고 안구 스틱으로 수분을 닦아냅니다. 자극 전극이 청소된 수직 두개골 표면에 맞는지 테스트합니다(자극 전극의 위쪽 가장자리는 측두골의 크리스타 가장자리와 일치해야 함). 필요한 경우 불독과 견인기를 다시 조정하거나 가위로 자극 전극의 모양을 만듭니다.
8. 자극 전극의 구멍을 전기 전도성 젤로 채우고 전극 가장자리에 얇은 접착제 층을 바르십시오.
9. 한 번의 정확한 움직임으로 자극 전극을 측두골의 건조한 표면에 놓고 미세한 핀셋으로 1분 동안 제자리에 단단히 고정합니다. 접착제에 습기가 닿지 않도록 하십시오. 필요한 경우 안구 막대기로 걸레질합니다.
   주의: 전극이 불안정해지면 제거하십시오. 뼈를 청소한 후 새 자극 전극으로 이 단계를 반복합니다.
10. 자극 전극의 가장자리에 치과 시멘트를 바르고 안구 스틱으로 조직에서 누출되는 수분을 지속적으로 건조시킵니다. 그런 다음 전체 자극 전극을 시멘트로 덮습니다.
11. 시멘트가 완전히 굳은 후 반대쪽 쪽에서 이 단계를 반복합니다.
12. 나사를 고정하기 위해 두개골 전체에 구멍을 뚫습니다. 구멍에 소형 나사를 박고 그 위에 치과용 시멘트를 놓습니다. 나사 직경에 비해 ~10% 더 작은 직경의 드릴 헤드를 사용하십시오.
13. 실험의 목적에 따라 커넥터를 케이블 끝에 납땜하여 표면에 놓고 시멘트로 덮거나, 기록 전극 및 광섬유를 계속 이식하거나, 두개골 위에 두개골 창을 준비합니다. 이 후자의 경우 커넥터를 납땜하고 끝에만 구조물에 고정합니다. 장기간 동시 TES 및 LFP 기록이 필요한 경우 단일 와이어 대신 앞서 언급한 전극 삼중항을 이식합니다.
    메모: 이 설정을 통해 공통 모드 자극 아티팩트를 제거할 수 있습니다8. 전극 이식 기록에 대한 자세한 내용은 이전 프로토콜을 참조하십시오.
14. 노출된 조직은 소독제로 충분히 씻어냅니다. 1 - 2% 리도카인을 피하주사합니다(총 용량 7mg/kg을 초과하지 마십시오).
15. 상처 가장자리를 떼어내고 커넥터/임플란트 주위의 간단한 단속 봉합사로 봉합합니다. 그런 다음 포비돈 요오드로 상처를 소독한다.
16. 5mg/kg의 카프로펜을 피하주사합니다. 필요한 경우 이 작업을 반복합니다.
    메모: 지역 윤리 허가 위원회에서 정한 요구 사항에 맞는 다른 진통제를 사용할 수 있습니다.
17. 마취를 중단하고 이어바와 노즈피스를 풀고 동물을 수술 후 회복 케이지에 넣어 의식을 되찾습니다.
18. 수술 후 첫 번째 시간 동안 동물이 면밀한 감독을 받고 있는지 확인하십시오. 주기적으로 임플란트 부위를 계속 모니터링하십시오.
    메모: 동물이 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치해서는 안 됩니다. 절차에서 완전히 회복될 때까지 동물을 개별적으로 수용합니다.

결과

그림 1: 자극 및 기록 전극 제작 단계. (A) 꼬인 전선을 구멍을 통해 꿰매고 포장에 고정한 후 벗겨진 전선을 캐비티에 감쌉니다. (B) 자극 전극의 최종 형태. 삽입 : 포장 내부에 감긴 전선; (C) 기록 전극의 측면도; (D) 기록 전극의 평면도. 삽입 사진: 기록 부위의 끝부분, 400μm 간격. (E) 경두개 자극 전극 배치의 수술 중 사진. 자극 전극은 일부 고정 나사와 함께 이미 이식

되어 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시아노아크릴레이트 액체	헨켈	록타이트 401
시아노아크릴레이트 겔	헨켈	록타이트 454
자극 전극용 와이어	피닉스 와이어 Inc.	36744MHW - PTFE 초소형 훅업 와이어
보드 스페이서	E-tec 인터커넥트	SP1-020-S378/01-55
커넥터	E-tec 인터커넥트	P2510I-02
자극 전극용 테이프 패키징	넥스페리아	74HC1G00GW	SOT-353 케이스가 있는 모든 집적 회로의 테이프 패키징을 사용할 수 있습니다
그립 시멘트 산업 학년	코크 Dentsply	675571(분말) 675572(용제)
전기 전도성 젤	엑스트라	ECG 젤
기록 전극선	캘리포니아 파인 와이어 (주)	.002 (50 미크론) 텅스텐 99.95 % (CFW 재료 # : 100-211), HMl-Natural, 3.0 인치 조각으로 절단, 원형, 절단 길이 조각 와이어
초극세 가위	함마허 인스트루먼트	스테인리스 HSB 544-09
스테인레스 스틸 튜브	비타니들 컴퍼니	29 RW, 304SS 튜빙, T.I.G. 용접 및 플러그
고속 로터리 톱	드레멜	모델 # 395
로터리 톱 홀더	드레멜	모델 # 220
로터리 톱 절단 휠	드레멜	모델 # 409
안구 스틱	로만-라우셔	Pro-ophta 안구 스틱
습식 소독제	이지스	베타딘
건조 소독제	와그너 제약	레셉틸 우레아
드릴링 머신	NSK-나카니시, 영국	Vmax35RV 팩
고정 나사	Antrin 미니어처 스페셜티, Inc.	000-120X1/16 SL 바인드 MS SS

.