Drosophila larval neuromuscular junction에서 시냅스 전류 기록

초록

출처: Vasin, A., et al. Focal Macropatch Drosophila larval Neuromuscular Junction의 시냅스 전류 기록. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오는 초파리 유충의 신경근 접합부에 있는 시냅스 부톤의 시냅스 전류를 기록하는 기술을 보여줍니다. 이 기술을 사용하면 단일 시냅스 부톤의 활동을 모니터링할 수 있으며, 이는 자발적 또는 비동기적 시냅스 활동이 향상된 돌연변이 파리 계통 연구에 중요합니다.

프로토콜

1. 기록 전극 제작

1. 유리 전극 당기기
   1. 미세 전극 풀러에 대해 다음 프로토콜을 사용합니다(재료 표 참조).
      1. 라인 1: 히트 510 풀 - 속도 30 시간 250; 라인 2: 히트 490 풀 - 속도 30 시간 250.
         메모: 시간 단위는 단위당 0.5ms에 해당합니다. 다른 단위는 상대적입니다. 열의 값은 램프 테스트가 수행된 후 모든 필라멘트에 대해 조정되어야 합니다.
   2. 현미경(35배 확대)을 사용하여 당겨진 전극의 내경이 7 - 10 μm 범위인지 확인합니다(그림 1A). 먼지가 쌓이지 않도록 단단히 밀폐된 용기에 모세관을 보관하십시오.
2. 화재 연마
   1. 마이크로 단조를 사용하여 파이어 폴리싱 모세관 (80 - 90 초 동안 최대 열 값의 1 - 2 %)을 사용합니다 (재료 표 참조). 연마된 전극의 최종 내경이 5μm인지 확인합니다(그림 1A).
3. 굽힘
   알림: 고배율 대물렌즈 아래 근육 상단에 전극을 배치하기 위해 두 번 구부립니다.
   1. 그림 1B에 표시된 장치를 사용하십시오. 매니퓰레이터에 전극을 고정하고 팁을 필라멘트 위에 건드리지 말고 위에 놓습니다.
   2. 열 값을 최대값의 60 - 70%로 설정하고 마이크로 포지의 페달을 1 - 2초 동안 누르십시오(재료 표 참조). L자형 바늘을 사용하여 전극 끝을 부드럽게 아래로 당깁니다(그림 1B 확대). 약 90o에서 구부립니다(그림 1C).
   3. 집게를 사용하여 손으로 토치의 화염 위에 전극을 잡고 첫 번째 굽힘에서 7 - 10mm의 거리에서 약 120^°의 각도로 두 번째 구부립니다(그림 1C).

2. 추가 준비 단계

1. 혈림프 유사 (HL3) 용액 준비 (mM) : 70 염화나트륨 (NaCl), 5 염화칼륨 (KCl), 20 염화 마그네슘 (MgCl₂), 10 탄산 수소 나트륨 (NaHCO₃ ), 5 트레할로스, 115 자당, 5 N-2- 히드 록시 에틸 피페 라진 -N'-2- 에탄 술폰산 (HEPES) 및 1mM 염화칼슘 (CaCl₂);pH를 7.3 - 7.4로 조정하십시오. 용액을 냉장고에 보관하고 매주 새로 만드십시오.
2. 유리 피펫을 구부릴 필요가 없다는 점을 제외하고는 유리 피펫을 기록하는 것과 동일한 방식으로 자극 피펫을 만드십시오.
   메모: 자극 전극의 제조는 도 28 및 도 27에 상세히 기재되어 있다. 화재 연마 후 최종 직경은 5 - 7 μm 범위 내에 있어야합니다.
3. 주사기에 연결된 미세 전극 홀더에 자극 피펫을 삽입합니다.

3. 여자 접합 전류(EJC)의 전기 기록

1. 녹음
   1. 준비물과 함께 페트리 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다(그림 2). 수조에 기준 전극을 삽입합니다.
   2. 기록 전극에 HL3 용액을 채웁니다. 10x 대물렌즈(재료 표 참조)에서 전극을 수조에 담그고 마이크로 매니퓰레이터(재료 표 참조)를 사용하여 복부 분절 2, 3 또는 4의 근육 6 및 7에 놓습니다(그림 3 A.1 및 A.2).
   3. 대물렌즈를 60x로 전환합니다(재료 표 참조). epi-fluorescence 또는 DIC optics를 사용하여 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 전극의 끝을 시냅스 부톤 위에 놓습니다(그림 3 B.1-3).
   4. 전극을 근육에 아주 부드럽게 누릅니다. 과도한 압력은 신경근 접합부(NMJ)를 손상시키거나 자발적인 시냅스 활동을 증가시킬 수 있습니다. 전극 끝이 막히지 않았는지 확인하고 막혔으면 교체하십시오.
   5. 스위치를 켜다 ampliifier, A/D 보드 및 컴퓨터.
   6. 전압 cl 선택amp 앰프의 모드.
   7. 수집 소프트웨어를 시작하고 '갭 프리' 모드를 선택합니다.
   8. 컴퓨터 화면에서 소형 여기 접합 전류(mEJC)가 나타나는 것을 관찰합니다.
   9. mEJC의 진폭이 0.2 - 0.7 nA.
      범위인지 확인합니다. 메모: EJC가 작을수록 기록 전극에 결함이 있거나 적절하게 배치되지 않았음을 나타냅니다.
2. 자극
   1. micromanipulator를 사용하여 시각적 제어 하에 자극 전극을 복부 분절 2 - 4를 자극하는 축삭 근처에 놓습니다.
   2. 전극 홀더에 연결된 주사기의 피스톤을 당겨 축삭돌기가 전극 내부로 당겨지도록 음압을 가합니다(그림 2).
   3. 자극기를 켭니다. 절연 장치(재료 표 참조)의 손잡이를 돌려 제로 전류를 설정한 다음 EJC가 나타날 때까지(또는 임계값에 도달할 때까지) 부드럽게 높입니다.
   4. EJC의 관찰을 위한 임계값과 비교하여 자극 전류가 약 2배 증가한 초임계값 영역에서 자극을 수행합니다.
      메모: 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이러한 자극 강도는 작용 전위 실패 및 작용 전위 발화를 피하는 데 최적입니다. 예를 들어, EJC가 0.2mA의 자극 전류에서 나타나는 경우 실험 전체에서 0.4mA의 전류를 사용합니다.

결과

그림 1. 마이크로피펫 제작의 마지막 단계. (A) 당기고 불 닦기 후에 전극 끝. (B.1) 팁 벤딩을 위한 설정. (B.2) 상자 영역이 오른쪽에 확대되어 표시됩니다. 전극과 필라멘트는 전극 팁이 와이어보다 약간 위에 위치하며 닿지 않도록 고정됩니다. (C.1) 기록 전극. (C.2) 상자 영역이 오른쪽에 확대되어 표시됩니다. 제 1 굽힘은 약 90 °의 각도를 갖고, 제 1 굽힘과 전극 팁 사이의 거리는 약 1mm입니다. 스케일 바 = 3mm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마이크로토치 1WG61	그레이너	AN-번호 1WG61	마이크로 토치
올림푸스 BX61WI	올림푸스	BX61WI	정립 현미경
올림푸스 Lumplan FL N 60x	올림푸스	UPLFLN 60배	현미경 대물렌즈 60X
올림푸스 UPlan FL N 10x	올림푸스	유플란 N 10X	현미경 대물렌즈 10X
나리시게 마이크로매니퓰레이터	나리시게	MHW-3	3 축 물 유압 Micromanipulator
NPI 전자 GmbH ELC-03XS	npi 전자 GmbH	ELC-03XS	전기생리학적 증폭기
A.M.P.I 마스터 8	A.M.P.I.	마스터 8	전기 자극기
A.M.P.I 아이소플렉스	A.M.P.I.	아이소-플렉스	자극 아이솔레이터
TMC 방진 테이블	티엠씨	전화: 63-9090	방진 테이블
TMC 패러데이 케이지	티엠씨	81-333-90	패러데이 케이지
디지데이터 1322A	축삭 기기	디지데이터 1322A	디지데이터
컴퓨터	작은 골짜기	델 디멘션 5150	Win XP OS가 설치된 컴퓨터
전극 홀더	WPI (영어)	MEH3SW	전극 홀더
광학 필터	오메가 옵티컬	XF 115-2	녹색 형광 단백질(GFP) 검출을 위한 필터 큐브
p클램프 8	축삭 기기	8.0.0.81	신호 기록용 소프트웨어
콴탄	사내 소프트웨어	-	신호 처리용 소프트웨어
Canton-S (와일드타입)	블루밍턴 스톡 센터	64349	제어 플라이 라인
cpx SH1	J.T. 리틀턴의 후한 선물	-	Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis(자발적 외포증가를 동반한 Complexin knock-out fly line)
CD8-GFP	블루밍턴 스톡 센터	5137	신경 형광등(GFP) 태그가 있는 플라이 라인

(영문) 년