뇌 절편의 뉴런 연구를 위한 자동화된 이미지 유도 패치 클램프 기법

초록

출처: Wu, Q., et al. 뇌 절편의 뉴런 연구를 위한 자동 이미지 유도 패치 클램프의 적용. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오에서는 뇌 절편을 기록실에 고정시키고 관심 세포를 찾아 컴퓨터 제어 현미경을 사용하여 집중시킵니다. 그런 다음 자동 이미지 처리 시스템은 패치 피펫을 정밀하게 배치하여 세포막을 밀봉하고 전기 신호를 모니터링합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 시스템 설정

1. 압력 제어 장치를 구성합니다.
   1. 회로 맵에 따라 압력 제어 장치를 조립합니다(그림 1). 전기 회로 회로도에 따라 제조된 인쇄 회로 기판(PCB)에 필요한 부품을 납땜합니다(그림 1b). 표준 저항기, LED(발광 다이오드), 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터(MOSFET), 커패시터 및 커넥터를 사용합니다. 솔레노이드 밸브를 PCB(인쇄 회로 기판)에 납땜합니다. 전선을 사용하여 공기 펌프와 공기 압력 센서를 PCB에 연결합니다.
      알림: 필요한 모든 부품을 사용할 수 있게 되면 압력 제어 장치는 약 2시간 내에 구성되어야 합니다.
2. 보조 데이터 수집(DAQ) 보드를 연결합니다.
   1. 표 1.
      와 같이 인쇄 회로 기판의 데이터 출력을 DAQ 보드에 연결합니다. 메모: DAQ 보드는 "단일 종단 모드"에서 실행됩니다. 포트 맵은 사용 설명서에 있습니다(재료 표 참조).
   2. "AIn Pr S"를 아날로그 입력(AI) 채널 중 하나에 연결하고 "R-Gr"을 보조 DAQ 보드의 아날로그 접지 중 하나에 연결합니다.
   3. 증폭기의 기본 출력을 AI 채널 중 하나에 연결하고 접지를 보조 DAQ 보드의 아날로그 접지에 연결합니다.
      알림: 표준 BNC 케이블을 사용하여 증폭기의 기본 출력을 연결할 수 있습니다.
   4. 다른 쪽 끝을 벗겨내고 양극 신호(즉, 구리 코어)를 AI 채널에 연결하고 접지(즉, 코어 주변의 얇은 와이어)를 아날로그 접지에 연결합니다. 패치 채널이 두 개 이상 사용되는 경우 두 번째 채널에 대해 이 단계를 반복합니다.
      참고 : DAQ 보드에 대한 아날로그 입력은 이후 단계에서 구성됩니다.
   5. 보조 DAQ 보드의 전원 출력에 전원을 연결합니다. 펌프에 별도의 12V 전원을 사용하십시오.
3. 튜브를 연결합니다.
   1. 공기 펌프와 두 개의 밸브를 연결합니다.
   2. 마지막 단계에서 3방향 커넥터를 사용하여 밸브 2 상단 포트의 소프트 튜브를 압력 센서 및 피펫 홀더에 연결합니다.
   3. 두 개의 피펫을 사용하는 경우 피펫 홀더에 연결된 튜브에 다른 3방향 커넥터를 추가합니다. 패치를 적용할 때 밸브와 사용 중인 피펫 사이를 수동으로 전환하십시오.
4. Autopatcher IG.
   설치 참고: 시스템 요구 사항: Autopatcher IG는 Windows 7을 실행하는 PC에서만 테스트되었습니다. 다른 운영 체제에 대해서는 검증되지 않았습니다. 설명된 절차는 특히 Table of Materials(자료 표)에 나열된 하드웨어에 적용됩니다.
   1. GitHub에서 Autopatcher-IG를 다운로드합니다(https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Python을 설치합니다(버전 및 다운로드 주소는 자료 표 참조).
   3. 명령줄 terminal.
      에 "pip uninstall PyQt4"를 입력하여 PyQt4 라이브러리를 제거합니다. 메모: 시스템은 Qwt 및 Opencv 라이브러리와의 호환성을 달성하기 위해 이전 버전의 PyQt4 라이브러리를 사용합니다.
   4. 기록 휠 파일(http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/)에서 Python 라이브러리를 설치합니다. Numpy(pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv(opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt(PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) 및 Qwt(PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl) 파일을 찾습니다.
      1. 휠 파일을 설치하려면 파일이 저장된 디렉토리로 이동하여 "pip install ***wheelfilename***.whl"을 입력합니다. "***wheelfilename***"을 파일의 실제 이름으로 대체합니다.
         참고: 휠 파일 이름의 "cp27"은 Python 2.7을 나타내고 "win32"는 Windows 32비트를 나타냅니다. "win32"가 작동하지 않으면 "win64"를 사용해 보십시오.
   5. CCD(전하 결합 장치) 카메라를 제어하려면 64비트(https://www.qimaging.com/support/software/)용 설치 프로그램을 다운로드하여 설치하십시오. 그런 다음 64비트(https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release)용 MicroManager를 다운로드하여 Python에서 카메라를 제어합니다.
   6. 매니퓰레이터와 현미경 스테이지를 제어하려면 제조업체에서 제공하는 제어 소프트웨어를 설치하십시오.
      메모: 이렇게 하면 매니퓰레이터를 제어하는 데 필요한 드라이버도 설치됩니다. 설치 패키지는 일반적으로 CD-ROM에 들어 있습니다.
   7. 보조 DAQ 보드를 제어하려면 DAQ 보드 구입과 함께 제공된 CD-ROM에서 Universal Library를 설치하십시오.
5. Autopatcher IG에 대한 하드웨어를 구성합니다.
   1. USB 포트를 통해 현미경 스테이지와 매니퓰레이터 컨트롤러를 컴퓨터에 연결합니다.
   2. COM 포트 번호를 장치 0: 현미경 스테이지, 장치 1: 왼쪽 매니퓰레이터, 유닛 2: 오른쪽 매니퓰레이터에 순서대로 "ports.csv" 구성 file "configuration" 폴더. ports.csv 파일의 다른 매개 변수(예: "SCI" 및 "1")는 변경하지 않고 그대로 둡니다.
      메모: COM 포트 번호 정보는 제조업체에서 제공하는 매니퓰레이터 구성 소프트웨어를 실행하여 찾을 수 있습니다. "설정" 탭으로 이동하여 "설정"과 "모션" 페이지를 선택하고 맨 위에 있는 각 탭의 레이블을 읽습니다. 또는 이 정보는 PC 장치 관리자에서 찾을 수 있습니다.
   3. DAQ 보드에 압력 센서와 패치 채널 1 및 2 (유닛 1 및 2에 해당)에 대한 아날로그 입력 채널 번호를 할당합니다. "configuration" 폴더의 "DAQchannels.csv" 파일에 채널 번호를 입력합니다.
      메모: 변경 사항을 저장할 때 정보가 변경될 수 있으므로 스프레드시트 대신 메모장 응용 프로그램으로 .csv 파일을 여는 것이 좋습니다.
6. Autopatcher IG를 실행합니다.
   1. 켜다 ampliifier, 현미경 컨트롤러 및 매니퓰레이터 컨트롤러. 앰프 소프트웨어가 실행 중입니다.
   2. 다음과 같이 명령줄 터미널에서 Python으로 Autopatcher IG를 실행합니다: 먼저 Autopatcher IG가 설치된 디렉터리(가장 일반적인 터미널의 경우 "cd" 명령)를 변경하고 명령줄 터미널에 "python Autopatcher_IG.pyw"를 입력한 다음 "Enter" 키를 누릅니다.
      참고: Autopatcher IG가 현미경 스테이지와 매니퓰레이터를 차지하여 Autopatcher IG가 하드웨어를 찾을 수 없으므로 Autopatcher IG를 실행하기 전에 매니퓰레이터 제어 소프트웨어를 실행하지 마십시오. 매니퓰레이터 제어 소프트웨어는 제어할 추가 모듈(예: 인라인 히터)이 있는 경우 Autopatcher IG가 완전히 시작된 후 실행할 수 있습니다.
7. 기본 파이펫을 교정합니다.
   1. 패치 피펫을 당깁니다. 풀드 글라스 피펫에 내부 용액을 채우고 헤드 스테이지에 로드합니다.
      참고: 빈 유리 피펫은 현미경 아래에서 대비가 다르며 부정확한 보정으로 이어질 수 있습니다.
   2. 피펫 팁을 현미경 시야로 이동하고 초점을 맞춥니다. 다이얼 패드를 사용하여 매니퓰레이터 및/또는 현미경을 이동하는 경우tage, 키보드에서 "z"를 눌러 좌표를 업데이트하십시오.
      메모: 좌표가 실시간으로 업데이트되기 때문에 키보드(현미경 스테이지: A/D - x축, W/S - y축, R/F - z축, 매니퓰레이터: H/K - x축, U/J - y축, O/L - z축, 1/2 - 단위 번호)를 사용하여 움직임을 제어하는 경우에는 좌표가 실시간으로 업데이트되기 때문에 이 작업이 필요하지 않습니다.
   3. 파이펫이 로드된 해당 장치의 기본 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)에서 "교정 시작" 버튼을 클릭합니다(그림 2).
      메모: 보정이 완료되면 팝업 창이 나타납니다.
      참고: 보정은 자동으로 수행되며 약 3.5분이 소요됩니다. 동일한 버튼(보정을 시작한 후 이제 "보정 취소"로 전환됨)을 클릭하면 보정 시도가 중단됩니다.
   4. 기본 GUI 하단의 "보정 저장"을 클릭하여 보정을 저장합니다(두 매니퓰레이터에 대한 현재 보정을 저장하고 나중에 로드할 수 있음).
      알림: 필드의 view 낮은(4 또는 10X) 배율과 높은(40X) 배율에서 2차 보정이 제대로 작동하려면 정렬되어야 합니다. 정렬 절차는 사용 중인 광학 시스템의 사용 설명서를 참조하십시오.
       

2. 자동 패치 클램프 절차

1. 급성 뇌 절편 준비
2. 패치 클램프용 유리 피펫을 준비합니다.
3. 뇌 절편 하나를 녹음실 중앙에 놓습니다. 슬라이스 홀드 다운 또는 "하프"로 슬라이스를 안정화합니다.
4. 형광 세포를 검출합니다.
   1. 4X 렌즈 아래에서 관심 영역을 찾습니다. 클릭 투 이동("CTM") 모드를 켜고 관심 영역의 중심을 클릭하여 현미경 스테이지를 이동합니다. 또는 키패드를 사용하여 현미경 스테이지(A/D - x축, W/S - y축, R/F - z축)를 이동합니다.
   2. 고배율 렌즈로 전환하고 키패드의 R/F를 사용하여 현미경을 z축으로 이동하여 초점을 조정합니다.
      알림: 저배율 및 고배율 렌즈 아래의 초점면이 z축에서 동일하거나 유사하도록 수조 수준을 조정하는 것이 좋습니다.
   3. 기본 GUI 열인 "Unit 0"에서 "Detect Cell" 버튼을 클릭합니다. TTL 신호로 설정의 LED 또는 레이저 광원을 제어할 수 없는 경우 LED/레이저를 수동으로 켜십시오. 셀 감지가 완료되면 팝업 창이 나타납니다.
      1. 필요한 경우 LED/레이저를 끕니다. 셀 좌표 목록이 "메모리 위치" GUI에 나타납니다. 좌표 옆에 있는 "X" 버튼을 클릭하여 목록에서 원하지 않는 셀을 제거합니다.
      2. 또는 타겟 세포가 형광 표지되지 않은 경우 기본 GUI에서 "마우스 모드"를 클릭합니다. 관심 있는 셀을 클릭하십시오. 숫자가 있는 노란색 점이 셀에 나타나고 셀의 좌표가 "메모리 위치" GUI에 나타납니다.
5. 보조 피펫을 교정합니다.
   1. 유리 피펫의 1/3을 내부 용액으로 채웁니다. 헤드 스테이지에 부착된 피펫 홀더에 피펫을 적재합니다.
   2. 저배율 렌즈를 사용하십시오. 피펫을 시야로 가져오고 키패드(H/K - x축, U/J - y축, O/L - z축)를 사용하여 초점을 조정합니다. "1"과 "2"를 사용하여 장치 1과 장치 2 사이를 전환합니다.
   3. "Load calibration"을 클릭하여 기본 교정을 로드합니다. 사용 중인 장치 아래의 기본 GUI에서 "Secondary calibration" 버튼을 클릭합니다. 예를 들어, 장치 2가 사용 중인 경우 "장치 2" 열에서 "보조 보정" 버튼을 클릭합니다. 팝업 창의 지시에 따라 고배율 렌즈로 전환합니다.
6. 대상 셀을 패치합니다.
   1. "MultiClamp"(즉, ampliifier) 소프트웨어가 실행 중입니다. "Patch control" 버튼을 클릭하여 "Patch control" GUI를 엽니다. 이 GUI를 여는 데 최대 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
   2. 메인 GUI "Unit 0" 열에서 "40X"를 선택하여 40X 배율 렌즈를 사용합니다. "Memory position" GUI의 좌표 목록에서 관심 셀 옆에 있는 "이동" 버튼을 클릭합니다. 현미경이 세포로 이동합니다.
   3. 메인 GUI에서 사용 중인 장치의 CTM 버튼을 클릭하면 마우스 클릭 후 이동할 수 있습니다. 관심 있는 셀을 클릭하십시오. 피펫 팁이 셀로 이동합니다.
   4. "패치 제어" GUI.
      에서 "패치" 버튼을 클릭합니다. 메모: 자동 패치가 시작되고 "패치 제어" GUI에서 압력과 저항을 모니터링할 수 있습니다.
      1. "Unit 1 selected" 버튼을 사용하여 두 장치 간에 입력 신호를 전환합니다.
         참고: 시스템은 대상 세포에 접근하고, 음압을 가하고, 세포막 전위를 일치시키고, 일련의 압력 및 저항 임계값과 논리를 기반으로 기가씰 형성을 감지합니다.
      2. "Patch control" GUI에서 해당 버튼을 클릭하여 언제든지 자동 프로세스를 조작할 수 있습니다. 예를 들어, "패치" 버튼을 다시 클릭하여 패치 평가판을 취소하고 "다음 단계"를 클릭하여 임계값에 관계없이 패치 프로세스를 다음 단계로 진행합니다.
         참고: 기가씰이 형성되면 팝업 창이 사용자에게 알리고 큰 음압과 함께 zap을 적용할 수 있는 옵션이 표시됩니다.
   5. "예"를 선택하면 zap과 suction을 결합하여 침입할 수 있습니다. 또는 "아니오"를 선택하여 흡입으로만 침입합니다.
      참고: 전체 세포 패치가 성공적으로 완료되면 사용자에게 실험 패치 로그를 저장하라는 팝업 창이 표시됩니다.
   6. 실험 패치 로그를 저장합니다.
      참고: 패치 평가판이 실패하면 팝업 창이 사용자에게 알리고 패치 프로세스가 재설정됩니다.
   7. 2.4단계로 돌아가서 다른 셀로 단계를 반복합니다.

결과

표 1. 인쇄 회로 기판(PCB)에서 보조 데이터 수집(DAQ) 보드 연결 구성. 이 표를 사용하여 PCB 출력 (왼쪽에서 첫 번째 열)을 DAQ 보드의 포트 (왼쪽에서 두 번째 열)에 연결하십시오. 보조 DAQ의 포트 이름과 번호는 단일 종단 모드를 나타냅니다.

분 ...

PCB의 콘센트	DAQ 보드의 포트 이름	DAQ 보드의 포트 #	말
두우트 V1	포트 A 채널 1	22	제어 밸브 1

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CCD 카메라	Q이미징	롤레라 볼트
전기생리학 장비	사이언티피카	슬라이스스코프 프로 2000	현미경 및 매니퓰레이터를 포함합니다. 이 원고에 설명된 제조업체가 제공한 매니퓰레이터 제어 소프트웨어는 "Linlab2"입니다.
증폭기	분자 장치	멀티클램프 700B	컴퓨터 제어 미세 전극 증폭기
디지타이저	분자 장치	축삭 디지데이터 1550
LED 광원	쿨 LED	pE-100	488nm 파장
데이터 수집 보드	측정 컴퓨팅	USB1208-FS	보조 DAQ. 에서 설명서를 참조하십시오 : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
솔레노이드 밸브	더 리 (주)	LHDA0531115H
공기펌프자리	가상 산업	VMP1625MX-12-90-채널
공기압 센서	프리스케일 반도체	MPXV7025G
슬라이스 홀드다운	워너 악기	64-1415년(SHD-40/2)	슬라이스 앵커 키트, 플랫형 RC-40 챔버용, 2.0 mm, 19.7 mm
파이썬	아나콘다	버전 2.7(Windows용 32비트)	https://www.continuum.io/downloads
나사 단자(2핀)	스파크펀	홍보 - 08084	나사 단자 3.5mm 피치(2핀)
N채널 MOSFET 60V 30A	스파크펀	COM - 10213
DIP 소켓 솔더 테일 - 8핀	스파크펀	PRT-07937
LED - 기본 빨간색 5mm	스파크펀	컴-09590
LED - 기본 녹색 5mm	스파크펀	컴-09592
DC 배럴 전원 잭/커넥터(SMD)	스파크펀	PRT-12748
벽면 어댑터 전원 공급 장치 - 12VDC 600mA	스파크펀	톨-09442
훅업 전선 - 구색(솔리드 코어, 22AWG)	스파크펀	PRT-11367
잠금 남성 x 여성 x 여성 마개	방주 - 플라스	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 플렉시블 튜빙	피셔 사이언티픽	제14-171-129	외경 : 1/8 in. 내경 : 1/16 in.
BNC 수-BNC 수 동축 케이블	Belkin 구성 요소	F3K101-06-E
560옴 저항기(5% 허용 오차)	라디오쉑	2711116
피코스프리처	일반 밸브	피코스프리처 II