생체 외 쥐 결장에서 결장 구심성 신경의 전기생리학적 기록

초록

출처: Meng, Y. et al., 쥐에서 결장 구심성 섬유의 전기생리학적 특성의 체외 특성화. J. Vis. Exp. (2017)

이 비디오는 생체 외 쥐 결장에서 결장 구심성 신경의 활동을 기록하는 방법을 보여주며, 양쪽 끝에 캐뉼레이션하고 식염수를 주입하여 내강 내압을 증가시키는 방법을 보여줍니다. 압력이 증가하면 신경 신호가 증가하여 자극을 나타냅니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 관류 용액 및 테스트 화합물의 제조

1. 113 mM 염화나트륨, NaCl, 5.9 mM 염화칼륨, KCl, 1.2 mM 인산이수소, NaH₂PO₄, 1.2 mM 황산 마그네슘, MgSO₄, 25 mM 중탄산 나트륨, NaHCO₃, 1.2 mM 염화칼슘, CaCl₂ 및 11.5 mM 포도당. 용액을 95% O₂ + 5% CO₂ 가스 혼합물로 포화시킵니다. ~500mL의 산소가 함유된 크렙을 냉장고에서 예냉합니다.
2. 필요에 따라 원액 테스트 화합물(에탄올 중 1mM 캡사이신 및 식염수 내 5-하이드록시트립타민 10mM)의 부분 표본을 준비합니다. Krebs(수조 적용용) 및 식염수(루미날 내 투여용)의 스톡을 사용 직전의 최종 농도로 희석합니다.

2. 녹음 전극의 준비

1. 기존 전극 풀러를 사용하여 내부 필라멘트(외경 1.5mm)가 없는 표준 유리관에서 기록 전극을 당깁니다. 당겨진 전극의 생크가 20mm에서 25mm 사이가 되도록 열 및 당기기에 대한 풀러 설정을 조정합니다.

3. 조직 수집

1. 펜토바르비탈나트륨(80mg/kg, i.p.)을 사용하여 쥐를 깊이 마취합니다.
2. 무균 상태를 보장하면서 메스를 사용하여 복벽의 정중선 절개를 수행하여 복강을 노출시킵니다. 장간막과 다른 조직을 옆으로 당겨 결장직장을 노출시킵니다.
3. 동물을 해부 현미경 아래에 놓습니다. 신중한 절개를 통해 좌측 골반신경절(PG)을 찾고 골반신경절(PN)과 요추신경절(LSN)이 연결되어 있는지 확인합니다. PG.
   에서 몇 밀리미터 떨어진 곳에서 이 신경을 잘라냅니다. 메모: PG는 결장직장 접합부에 가깝습니다. 일반적으로 요추 척수에서 3 - 4 PN이고 LSN은 PG로 돌출합니다(그림 1).
4. 심포근을 잘라 직장을 노출시킵니다. 결장직장 위의 조직(즉, 요로 방광 등)을 제거합니다. PG는 그대로 두도록 주의하십시오.
5. 펜토바르비탈(pentobarbital)을 과다 투여하여 쥐를 희생시킨다. PG에서 약 3cm 위로 결장을 절제하고 집게를 사용하여 동물에서 결장직장을 제거합니다.
6. colorectum을 미리 냉각된 Krebs 용액으로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다. 결장을 부드럽게 씻어내어 대변을 제거합니다. PG를 손상시키지 않고 남은 방광 및 기타 조직을 조심스럽게 제거하십시오.

4. 결장 구심성 신경의 해부

1. 결장을 기록 챔버(20mL)에 넣고 발암화된 크렙스 용액으로 조직을 지속적으로 관류합니다. 관류 속도를 15mL/분으로 설정합니다.
2. 구강과 항문 말단 모두에서 결장직장을 캐뉼레이트합니다. 경구에서 항문 방향으로 10mL/h의 속도로 식염수를 함유한 결장의 내강내 주입을 시작합니다.
3. 해부 현미경 아래에서 주요 PG를 찾습니다. 곤충 핀을 사용하여 신경절을 노출시킵니다. 신중한 해부를 통해 신경절에서 나와 결장을 향해 뻗어 있는 미세한 신경 가지를 찾으십시오(그림 1). 신경절에 가까운 신경을 잘라냅니다.
   참고: 그림 1은 PG 원위부의 신경 분지에서 녹음을 보여줍니다. 신경은 아마도 골반과 요추 스플랑크닉 구심성 섬유의 혼합물을 포함하고 있는 것으로 추정됩니다. 대안적으로, PN 및/또는 PG에 근접한 LSN으로부터 기록이 이루어질 수 있다.
4. 가열 수조를 켜고 Krebs 용액을 가열하여 챔버 온도를 34 ± 0.5 ° C로 유지합니다.

5. 흡입 전극의 준비

1. 미리 당겨진 유리 피펫(2단계)을 가지고 해부 현미경으로 검사합니다. 한 쌍의 집게로 전극 끝을 부러뜨려 기록할 신경의 직경과 호환되는 크기가 되도록 합니다.
2. 팁을 더 밝은 플레어에 가깝게 배치하여 경사지
게 합니다.

6. 전기생리학적 기록

1. 경사진 전극을 전극 홀더에 연결합니다. 10mL 주사기를 홀더의 측면 포트에 연결하여 전극에 음압 또는 양압을 가합니다.
2. 홀더를 헤드에 연결tage 바이오 앰프 및 헤드스테이지를 매니퓰레이터에 장착합니다.
3. 전극을 티슈 수조로 옮기고 홀더의 은선에 닿을 때까지 부드럽게 흡입하여 전극에 Krebs 용액을 채웁니다. 전극 끝을 신경의 절단된 끝 부분에 가깝게 놓고 음압을 가하여 신경을 전극으로 빨아들입니다. 신경의 ~1mm가 전극으로 당겨져 단단히 밀봉되도록 더 많은 음압을 가합니다.
4. 바이오 앰프를 켜고 필터를 300 - 3,000 Hz로 설정합니다. 스파이크 데이터 처리 소프트웨어가 있는 컴퓨터를 사용하여 오실로스코프의 신호를 모니터링하고 신경 신호(20kHz 샘플링 속도) 및 내강 압력 신호(100Hz 샘플링 속도)를 기록합니다.

7. Colonic Afferent Sensitivity 테스트

1. 배출구 캐뉼라의 3방향 탭을 닫아 결장의 램프 팽창을 가하는 동시에 지속적으로 발광내로 주입합니다. 60mmHg에 도달할 때까지 내강 압력을 모니터링하고, 이때 배수 캐뉼러의 3방향 탭을 엽니다.

결과

그림 1. 쥐 결장 구심성 신경의 전기 생리학적 기록 In vitro. A. 아니요. 쥐의 생체 외 "튜브" 결장 준비에 대한 개략도. PG가 부착된 colorectum은 기록 챔버에서 과융합되고 양쪽 끝에서 캐뉼레이션됩니다. 내강내 주입은 주사기 펌프를 사용하여 이루어지며 구강에서 항문 방향으로 이동합니다. 결장의 팽창은 배출구 캐뉼라의 3방향 탭(d)을 닫음으로써 이루어집니다. PG의 미세한 신경 가지를 절단하고 흡입 전극을 사용하여 기록합니다. PG에 조인하는 LSN의 분기와 PN의 세 분기도 표시됩니다. a. 결장으로 돌출된 미세한 신경의 근위부 절단 끝. b. 신경의 원위 절단 끝이 전극으로 빨려 들어갑니다. c. ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
나트륨 펜토바르비탈	상하이 Westang 생명 공학	나558
캡사이신	시그마	엠2028
전극 풀러	마이크로 데이터 계측기 Inc	PMP107
Neurolog System(생체 증폭기)	디지타이머, 주식회사	신경로그 시스템
A/D 컨버터	캠브리지 일렉트로닉 디자인	마이크로1401
데이터 처리 소프트웨어	캠브리지 일렉트로닉 디자인	Spike2 버전 6
은선	세계적인 정밀 기기	제12
유리관	세계적인 정밀 기기	AN-번호 1B150-4
전극 홀더	세계적인 정밀 기기	MEH3SBW
가열 수조	시	GR150
해부 현미경	라이카	줌2000
해부 현미경	세계적인 정밀 기기	PZMIII-학사
담배 라이터	어떤	해당 없음
수술 도구	세계적인 정밀 기기	해당 없음
곤충 핀	0.1mm 스테인레스 스틸 와이어로 집에서 만든	해당 없음
쓰리 웨이 매니퓰레이터	세계적인 정밀 기기	키트프-R
쥐	어떤	해당 없음	모든 변형/성별을 사용할 수 있습니다.

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