대뇌 혈관 내피 세포의 미토콘드리아 기능 평가

Abstract

출처: Rellick, S. L. et al. 대뇌 혈관 내피 세포의 생체 에너지 기능 평가. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 세포외 플럭스 분석을 사용하여 대뇌 혈관 내피(CVE) 세포의 미토콘드리아 기능을 평가하는 방법을 보여줍니다. CVE 세포는 세포외 플럭스 세포 배양 플레이트에 도금되어 있습니다. 세포 외 플럭스 센서는 bioanalyzer에 로딩 및 교정하기 전에 수화됩니다. 그런 다음 세포가 포함된 플레이트가 분석을 위해 로드됩니다.

Protocol

1. 세포 배양 플레이트에 대뇌 혈관 내피(CVE) 세포를 시딩 및 처리

1. 96웰 세포외 플럭스 세포 배양 플레이트의 시드 CVE 세포(bEnd.3 세포): 80μL/웰. 세포 배양 플레이트를 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에 놓습니다. 참고: 웰당 16 × 10³개의 셀은 24시간 이내에 60 - 80% 포화도에 도달합니다.
2. 세포가 화학 물질에 노출되는 경우 세포가 플레이트 바닥에 부착 된 후 (파종 후 8-24 시간) 처리를 추가하십시오.
   메모: transfection 실험의 경우, 완전 성장 배지에 항생제를 첨가하지 마십시오.

2. 바이오분석기를 이용한 미토콘드리아 기능 평가

1. 분석을 시작하기 전에 150μL의 세포외 플럭스 캘리브런트 용액을 플레이트에 추가하고 CO₂ 없이 37°C에서 밤새 배양하여 검량제로 세포 외 플럭스 센서 카트리지를 수화합니다.
2. 플레이트 세척기 스테이션을 사용하여 세포 배양 배지를 pH 7.0 세포외 플럭스 분석 배지로 변경합니다. 30 - 60 분 동안 CO₂없이 37 ° C에서 세포를 배양하십시오.
3. Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)에서 8μM 올리고마이신, 4.5μM 카르보닐시아나이드 4-(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP), 10μM 로테논 및 10μM 안티마이신 A의 작업 용액을 준비합니다. 25 μL의 원액을 카트리지 주입 포트에 로드합니다: 포트 A, 올리고마이신; 포트 B, FCCP; 포트 C, 로테논 및 항마이신 A와 세포외 플럭스 분석 배지. 표 1에 설명된 대로 분석 프로토콜을 구현합니다.
4. 수화 카트리지를 bioanalyzer에 로드하고 "시작" 버튼을 클릭하여 보정을 수행합니다. 보정이 완료되면 카트리지 바닥판을 제거하고 "Unload Cartridge" 프롬프트를 클릭하여 셀 플레이트를 로드합니다. 모든 측정이 완료될 때까지 분석을 계속합니다.
5. 데이터 파일을 열고 바이오분석기에서 속도 값을 가져옵니다. 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다.

표 1. 기기 실행 프로토콜입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
bEnd.3 세포주	증권 시세	CRL-2299	25-30 통로
둘베코의 변형 독수리 배지(DMEM)	증권 시세	2002년 30월 30
소 태아 세럼	애틀랜타 바이오로직스	S12450	최종전에서 10%
페니실린/스텝토마이신	하이클론	SV30010	1×100 스타킹
0.25% 트립신 0.03% EDTA 용액	코 닝	25-053-CI
나트륨 피루브산	코 닝	25-000-CI	최종에서 1.0 μM
포도당	시그마	CAS 50-99-7	최종에서 25 mM
올리고마이신	시그마	O4876	최종에서 1.0 μM
카르보닐시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP)	시그마	C2920	최종에서 0.5μM
로테논	시그마	R8875	최종에서 1.0 μM
안티마이신 A	시그마	CAS 1397-94-0	최종에서 1.0 μM
플레이트 세척 스테이션	Seahorse 생명과학
세포외 플럭스 바이오분석기	Seahorse 생명과학	엑스페96
세포외 플럭스 세포 배양 플레이트	Seahorse 생명과학	제102416-100
세포외 플럭스 센서 카트리지	Seahorse 생명과학	제102416-100
Extracellular flux calibrant 용액	Seahorse 생명과학	제100840-000
세포외 플럭스 분석 배지	Seahorse 생명과학	제102365-100	분석 전에 완충된 PH