생체 외 마우스 Jejunum 분절에서 장간막 구심성 신경 활동의 기록

초록

출처: Nullens, S., et al. 마우스 Jejunal 및 Colonic segments에서 장간막 구심성 신경 활동의 체외 기록. J. Vis. 특급. (2016).

이 비디오는 구심성 신경 활동에 대한 조직 압력과 운동 변화의 영향을 연구하기 위해 절개된 마우스 제주널 분절에서 장간막 구심성 신경의 전기 신호를 기록하는 과정을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 제주널 구심성 신경의 준비

1. 지역 윤리 위원회에서 실험 전에 승인한 청소년 또는 성인 설치류에 대해 설치류 안락사를 수행합니다(예: 말기 진정제 투여 후 심장 천자, 자궁 경부 탈구 등).
   메모: 우리는 동물을 희생시키기 위해 경추 탈구를 사용했으며, 그 결과 조직이 체외에서 추가 처리됨에 따라 추가 마취나 수술 후 관리가 필요하지 않은 실험을 할 수 있었습니다.
   메모: 나이는 장간막 구심성 기계감각 기능을 약화시키는 것으로 나타났으므로 연구자들은 단일 실험 기간 동안 특정 연령 그룹을 고수할 것을 조언합니다.
2. 희생된 실험용 동물을 누운 자세로 눕히고 메스를 사용하여 피부와 복부 근육층을 통해 xiphoid process에서 치골까지 이어지는 복부 정중선 절개를 수행합니다.
3. 복강 내 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해 차가운 크렙스 용액으로 복강을 목욕시킵니다(크렙스 조성: 120.03 mM NaCl, 6.22 mM KCl, 1.57 mM NaH₂PO₄, 15.43 mM NaHCO₃, 1.21 mM MgSO₄, 11.52 mM D-포도당 및 1.52 mM CaCl₂).
4. 십이지장 굴곡 바로 원위부에서 시작하여 소장을 약 20cm 정도 절제하고, 주변 구조를 손상시키지 않도록 주의하며, 제주르 혈관과 구심성 신경을 포함하는 장의 장간막을 온전하게 유지하여 날카로운 가위를 사용하여 제주눔 전체를 신속하게 절제합니다.
   메모: 복강 내의 단순한 제주널 해부의 경우, 육안으로 쉽게 시각화할 수 있으므로 실체현미경을 사용할 필요가 없습니다.
5. 절제된 제주넘을 얼음처럼 차가운 크렙스 용액에 넣고 얼음 위에 보관하면서 크렙스 용액에 탄수화물(95% O₂, 5% CO₂)로 지속적으로 산소를 공급합니다.
6. 날카로운 가위로 약 3cm 길이의 고리로 제주눔을 자릅니다. 혈관과 스플랑크닉 신경을 포함하는 장간막 다발을 각 고리의 중심 근처 어딘가에서 관찰하십시오.
7. 뭉툭한 카테터를 사용하여 Krebs 용액으로 각 세그먼트를 세척하여 체외에서 조직 샘플의 악화를 가속화하는 소화 효소를 포함하는 내강 내용물과 키임을 제거합니다.
   메모: 융모의 파괴는 구심성 신경 활동을 변화시킬 수 있는 매개체의 방출을 초래할 수 있으므로 세척하는 동안 루프의 내강을 손상시키지 않도록 주의하십시오.
8. 구심성 신경 활동을 측정하기 위한 분절(예: Treitz 인대의 원위부에 있는 첫 번째 제주날 분절 또는 십이지장 굴곡)을 식별하고 이를 실리콘 엘라스토머 층으로 코팅된 특수 제작된 기록 챔버에 배치합니다.
   메모: jejunum의 시작은 해부학적으로 Treitz의 인대가 소장을 가로지르는 소장의 일부로 정의되며, 이를 duodenojejunal flexure라고도 합니다.
   메모: 실험이 시작되기 훨씬 전에 기록 챔버의 바닥을 얇은 실리콘 엘라스토머 층으로 덮습니다. 제조업체의 지침에 따라 이 엘라스토머 층을 준비하십시오.
9. 10ml/min의 속도로 따뜻한 발암성 Krebs 용액으로 챔버를 지속적으로 관류하고 기록 챔버의 Krebs' 온도를 34°C로 일정하게 유지합니다.
10. 장기 욕조에 제주날 분절을 장착하여 구강 끝이 내강 흐름을 제공하는 주사기 드라이버에 연결되고 복부 말단이 유출에 연결되도록 합니다. 세그먼트를 약간 늘리되 과도한 장력을 가하지 않도록 주의하십시오. 4/0 실크 합자를 사용하여 유입 및 유출 포트에 양쪽 끝을 단단히 부착합니다.
11. 주사기 드라이버를 구강 말단에 부착하고 10ml/hr의 속도로 Krebs 용액(무산소, 주변 온도)으로 jejunal 세그먼트를 광내 관류합니다.
12. 곤충 핀을 사용하여 장착된 장 분절의 장간막을 실리콘 엘라스토머 바닥층에 평평하게 고정합니다. 장간막 다발의 시각화를 최적화하기 위해 장간막을 늘립니다. 뭉치나 제주눔에 무리를 가하지 마십시오.
13. 테스트 수행 amp 장 분절의 내강내 압력이 60mmHg에 도달할 때까지 출력 포트를 닫아 발광내 Krebs 용액이 장착된 분절에서 누출되지 않는지 확인합니다. 중단 없이 광내압이 완만하게 상승하는 것을 관찰합니다.
14. 초기 팽창 단계에서 분절(연동파)의 작은 수축을 관찰합니다. 필요한 경우 Krebs 용액에 1μM의 L형 칼슘 채널 차단제 니페디핀을 추가하여 연동 활성을 차단합니다.
    메모: 니페디핀과 함께 Krebs 용액에 1μM의 아트로핀을 추가하면 장 부분이 완전히 마비됩니다.
15. 실체 현미경으로 두 개의 작은 핀셋으로 장간막의 지방 조직을 부드럽게 잡아당겨 지방 조직에 묻혀 있는 혈관과 구심성 신경이 손상되지 않도록 주의하여 지방 조직을 부드럽게 떼어내기 시작합니다.
16. 제주눔에서 멀리 떨어진 곳에서 시작하여 장간막 다발의 두 혈관을 노출시킵니다.
17. 두 혈관 사이에 있는 구심성 제주널 신경(centerent jejunal nerve)을 지방 조직에 캡슐화된 얇고 하얀 실로 관찰합니다. 장간막 혈관 및/또는 구심성 신경의 초기 식별이 어려운 경우에만 핀셋을 사용하여 지방 조직을 부드럽게 벗겨내어 제주눔 쪽으로 더 가깝게 해부합니다.
18. 신경에 부착된 지방 조직을 제거하여 수 밀리미터 거리에 걸쳐 분절의 장간막 신경을 자유롭게 해부합니다.
19. 날카로운 조직 가위를 사용하여 신경을 절제합니다. 필요한 경우 작은 핀셋으로 부드럽게 잡아당겨 남아 있는 지방과 결합 조직, 표신경막 덮개를 벗겨냅니다.
20. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 플런저가 있는 주사기에 연결된 흡입 전극의 끝을 장기 수조로 내립니다. 그런 다음 플런저를 조작하여 장기 수조에서 일부 크렙스 용액을 부드럽게 흡인하여 전극 끝이 크렙스 용액에 잠기도록 합니다(그림 1). Krebs 용액이 흡입 전극 내부의 와이어 전극을 덮고 있는지 확인합니다.
    메모: 실험을 시작하기 전에 피펫 풀러를 사용하여 와이어 전극이 포함된 붕규산 유리 흡입 모세관을 준비합니다.
21. 흡입 전극의 끝을 transected afferent nerve strand 바로 옆에 놓고 transection된 신경 가닥을 전체 길이에 걸쳐 모세혈관으로 끌어당깁니다.
22. 전극의 끝을 지방 조직 쪽으로 움직여 플런저로 단단히 흡인하면서 이를 유리 모세관으로 흡인하여 장기 욕조의 내용물로부터 모세혈관의 신경을 기계적으로 '밀봉'합니다.
23. 데이터 수집 시스템을 사용하여 구심성 신경 활동의 기록을 확인합니다(예: 램프 팽창으로 인한 구심성 발사 증가(vide infra)를 수행). 신경을 흡입 전극으로 분리한 후 실제 실험을 수행하기 전에 자발적인 구심성 신경 활동의 안정적인 상태를 얻기 위해 15분 동안 준비를 안정화합니다.
24. 램프 팽창을 수행하려면 출력 포트를 닫아 장 분절을 팽창시켜 압력을 점진적으로 상승시킵니다(최대 60mmHg). 3회 연속 램프 팽창(15분 간격)으로 재현 가능한 다중 장치 방전이 생성되는 경우에만 원하는 실험 프로토콜을 수행합니다(그림 2).

결과

그림 1: 특수 제작된 녹음 챔버 및 흡입 전극의 개략도. 흡입 전극과 기록 챔버가 있는 기술 설정에 대한 자세한 개요.

그림 2: Jejunal Afferent Nerve Activity의 In vitro 기록의 대표적인 추적. 베이스라인에서 및 최대 60mmHg(하단 패널)까지 2번의 램프 팽창에 대한 응답으로 jejunal 다중 단위 구심성 신경 활동(imp.sec-1)(상단 패널)의 일반적인 기록 및 신경 신호(세 번째 패널)에서 다른 단일 단위의 후속 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화나트륨 (NaCl)	VWR 화학 물질	2,78,10,295	복합 크렙스 용액
염화칼륨 (KCl)	아크로스 유기물	196770010	복합 크렙스 용액
인산이수소나트륨(NaH2PO4)	VWR 화학 물질	1,06,34,61,000	복합 크렙스 용액
중탄산 나트륨 (NaHCO3)	머 크	1,06,32,91,000	복합 크렙스 용액
황산마그네슘(MgSO4)	머 크	1,05,88,61,000	복합 크렙스 용액
염화칼슘(CaCl2)	머 크	2,38,11,000	복합 크렙스 용액
D-포도당	VWR 화학 물질	1011175P	복합 크렙스 용액
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