Vomeronasal Sensory Neuron의 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 구축

초록

출처: Ackels, T., et al. 마우스 Vomeronasal Organ의 급성 조직 절편에서 정의된 세포 집단에 대한 심층 생리학적 분석. J. Vis. 특급 (2016)

프로토콜 비디오는 마우스의 vomeronasal organ(VNO)의 감각 뉴런에서 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프를 설정하는 방법을 설명합니다. 형광 표지된 감각 뉴런이 있는 코로나 VNO 슬라이스가 기록 설정에 배치됩니다. 표지된 뉴런은 화학적 자극에 대한 반응으로 전기생리학적 기록을 위해 전체 세포 구성의 기록 피펫으로 패치됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 솔루션 준비

1. 세포 외 용액 S₁ : 4- (2-Hydroxy-ethyl) piperazine -1- ethanesulfonic acid (HEPES) 완충 세포 외 용액 (mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES; pH = 7.3 (NaOH로 조정); 삼투압 = 300 mOsm (포도당으로 조정).
2. 세포 외 용액 S₂ : 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgSO₄, 5 bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)를 함유하는 (mM 단위) 발암-산소화(95% O₂, 5% CO₂) 세포 외 용액을 제조합니다. pH = 7.3; 삼투압 = 300 mOsm (포도당으로 조정).
3. 조직 포매를 위해 4% 저겔화 온도 아가로스 용액(S₃)을 준비합니다: 4% 저겔화 온도 아가로스. 자석 교반기와 함께 100ml 유리 실험실 병에 S₁ 50ml에 저겔화 아가로스 2g을 녹입니다. 아가로스를 녹이려면 70°C의 수조(뚜껑이 단단히 닫히지 않은 상태)에 약 20분 동안 또는 저어주는 동안 용액이 투명해질 때까지 병을 넣습니다. 식히고 녹은 아가로스를 42°C의 두 번째 수조에서 더 사용할 때까지 보관하십시오.
4. 세포 내 용액 S₄ : 143 KCl, 2 KOH, 1 에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA), 0.3 CaCl₂ (free Ca²⁺ = 110 nM), 10 hepes, 2 아데노신 5'- 트리포스페이트 마그네슘 염 (MgATP), 1 구아노신 5'- 트리포스페이트 나트륨 염 (NaGTP)을 포함하는 피펫 용액; pH = 7.1 (KOH로 조정); 삼투압 = 290 mOsm.
5. 개별 실험 설계에 따라 S₁, S₂ 및 S₄의 조성을 수정/조정합니다(예: 특정 유형의 전압 활성화 전류를 분리하기 위한 약리학적 차단제).

2. VNO 해부 및 임베딩

1. CO₂에 잠깐 노출되어 동물을 희생시키고 날카로운 수술 용 가위를 사용하여 목을 베십시오. 참고: 동물을 제물로 바치는 것부터 VNO 캡슐을 얼음 위에 올려놓는 것까지의 시간은 매우 중요하므로 시간을 2분 미만으로 최소화하십시오. 조직 생존력을 유지하려면 완전히 절개된 두 VNO를 30분 이내에 아가로스에 삽입하십시오.
2. 큰 수술 용 가위로 아래턱을 제거하십시오. 입강을 통해 들어가 양쪽의 하악골과 근육을 따로 자릅니다.
3. 머리의 나머지 부분을 큰 페트리 접시에 거꾸로 놓습니다.
4. 중간 집게로 위턱의 피부와 코 끝 주위를 잡아당겨 앞니에 더 잘 접근할 수 있도록 합니다.
5. 뼈 가위를 사용하여 앞니 방향으로 ~45° 각도로 앞니의 가장 큰 부분을 잘라냅니다(그림 1A). 이렇게 하면 비강에서 VNO 캡슐을 쉽게 제거할 수 있습니다.
   메모: VNO 캡슐 끝의 손상을 방지하기 위해 치아 뿌리까지 자르지 마십시오.
6. 중간 집게로 윗부분의 단단한 상부 입천장을 잡고 평평한 각도로 한 조각으로 조심스럽게 벗겨냅니다(그림 1B).
   메모: 얼음처럼 차가운 S_로 반복해서 헹굽니다 2.
7. 마이크로 스프링 가위를 사용하여 보머 뼈 끝과 턱 사이의 뼈 융합을 자릅니다. 팁의 구부러진 부분이 VNO에서 바깥쪽을 향하도록 시저 팁을 삽입하고 VNO 캡슐 옆의 왼쪽과 오른쪽 모두에서 작은 단계로 뼈를 조심스럽게 자릅니다.
8. VNO 캡슐을 제거하려면 마이크로 스프링 가위를 사용하여 꼬리 부분의 보머 뼈를 자르고 중간 집게를 사용하여 비강에서 보머 뼈를 조심스럽게 들어 올립니다. 즉시 VNO를 얼음 젤 팩의 실체 현미경 아래에 있는 작은 페트리 접시로 옮겨 나머지 해부 단계를 수행합니다.
9. 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해 소량의 얼음처럼 차가운 S₂로 VNO를 헹굽니다.
10. 중간 집게로 보머 뼈의 뒤쪽을 잡아 VNO 연조직을 포함하는 연골낭을 분리합니다. 두 VNO 사이의 분할이 보이도록 등쪽 보기를 위해 캡슐을 배치합니다(그림 1D_i).
11. 미세한 집게의 끝을 사용하여 보머 뼈를 뒤쪽 부분에 고정한 상태에서 중앙 뼈에서 두 연골 VNO 캡슐을 분리합니다.
    메모: 연골낭 가장자리에만 집게를 사용하고 섬세한 감각 상피가 쉽게 손상되므로 연골을 뚫지 않도록 각별히 주의하십시오.
12. 두 VNO가 분리되면 첫 번째 VNO를 캡슐화하는 연골을 제거하기 시작합니다.
13. 하나의 가는 집게로 캡슐의 상단 가장자리를 잡고 이전에 보머 뼈(내측)에 부착되어 있던 연골 벽을 분리합니다.
14. 남아있는 연골을 제거하려면 구부러진 측면이 접시 바닥으로 된 VNO를 돌리고 집게를 사용하여 한쪽 연골을 단단히 고정합니다. 연골과 VNO 사이의 매우 평평한 각도로 뒤쪽에서 두 번째 미세한 집게를 조심스럽게 움직여 조직과 연골 사이의 연결을 느슨하게 합니다.
15. 감각 상피가 손상되지 않도록 VNO를 꼬리 끝으로 잡고 연골에서 VNO를 천천히 떼어냅니다.
16. VNO가 캡슐에서 활용되면 슬라이스 과정에서 남아 있는 연골 조각이 주변 아가로스에서 조직을 분리하므로 남아 있는 모든 작은 연골 부분을 제거해야 합니다.
17. 조직 손상을 방지하기 위해 첫 번째 절개된 VNO에 얼음처럼 차가운 S₂ 를 한 방울 떨어뜨립니다. 측면에 큰 혈관이 보이기 때문에 장기가 여전히 손상되지 않았으며 해부 중에 심하게 손상되지 않았음을 나타냅니다(그림 2A_ii). 혈관이 손상된 경우, 전체 형태가 명확하게 손상되지 않는 한 VNO를 계속 절단하는 것이 좋습니다.
18. 즉시 두 번째 VNO를 해부합니다.
19. VNO를 삽입하려면 두 개의 작은 페트리 접시를 녹인 S₃로 가장자리까지 채웁니다(42°C의 수조에 보관, 1.3 참조).
20. 감각 상피의 손상을 방지하기 위해 미세한 집게로 더 넓은 꼬리 끝의 VNO를 잡습니다.
21. VNO를 아가로스에 담그고 수평으로 앞뒤로 여러 번 움직여 표면의 기포뿐만 아니라 세포외 용액의 필름을 제거합니다.
22. 꼬리 끝이 접시 바닥을 향하도록 VNO를 수직으로 배치합니다. 겸자로 VNO를 직접 꼬집는 대신 집게 끝을 VNO.
    메모: 임베딩(embedding) 중 방향은 실험 중 감각 뉴런에 대한 슬라이스 평면(slice plane)과 접근성을 결정하기 때문에 매우 중요합니다.
23. 젤 아이스팩에 접시를 놓고 아가로스가 굳을 때까지 기다립니다.
    참고: 아가로스가 응고되기 시작하면 주변 아가로스에서 조직이 분리되므로 VNO 방향을 변경하지 마십시오.

3. 코로나 VNO 조직 슬라이싱

1. 작은 주걱을 사용하여 작은 접시의 아가로스 블록을 큰 페트리 접시의 뚜껑에 넣고 아가로스를 거꾸로 뒤집어 VNO의 꼬리 끝이 위를 향하도록 합니다.
2. 외과용 메스를 사용하여 블록을 피라미드 모양으로 자릅니다(끝에서 3-4mm, 하단에서 8-10mm). 내장된 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.
3. 슈퍼 접착제를 사용하여 피라미드 모양의 블록을 비브라톰 표본 플레이트의 중앙에 고정하고 접착제가 완전히 마를 때까지 ~1분 동안 기다립니다.
4. 시편 플레이트를 슬라이싱 챔버로 옮기고 그에 따라 두 번째 VNO를 준비합니다. 두 번째 시편과 함께 플레이트를 사용할 때까지 4°C로 유지하십시오.
5. 다음 설정의 진동 블레이드 마이크로톰을 사용하십시오: 두께: 150-200 μm; 속도: 3.5 a.u. = 0.15 mm/sec; 주파수: 7.5 a.u. = 75 Hz. 해부 현미경으로 절편 형태를 간략하게 검사한 후 사용할 때까지 절편을 산소화 챔버로 옮깁니다. 슬라이스는 몇 시간 동안 보관할 수 있습니다.

4. 단일 세포 전기 생리학적 기록

1. 녹화를 위해 침수 대물렌즈, Dodt 또는 적외선 미분 간섭 대비(IR-DIC) 및 에피 형광이 장착된 정립 고정 스테이지 현미경과 냉각식 전하 결합 장치(CCD) 카메라를 사용하십시오. 데이터 수집을 위해 패치 클램프 증폭기, 헤드 스테이지, 아날로그-디지털/디지털-아날로그(AD/DA) 인터페이스 보드 및 컴퓨터(녹음 소프트웨어 포함)를 사용하십시오.
2. 10-20개의 패치 피펫(4-7MΩ)을 준비합니다. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관(1.50mm 외경[OD]/0.86mm 내경[ID])에서 피펫을 당기고 마이크로포지로 파이어폴리싱합니다.
   메모: 피펫 팁의 화재 연마는 다소 작은 VSN을 패치할 때 매우 중요합니다. 이것은 높은 저항 밀봉을 얻기 위해 음압을 가할 때 세포막이 파열되는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 연마 후 피펫 개구부는 약 1μm가 되어야 합니다.
3. 피펫을 사용할 때까지 손상과 먼지 축적을 방지하기 위해 피펫 보관 용기에 보관하십시오.
4. 실험 설계에 따라 용액 저장소와 튜브를 채워 관류 시스템을 준비합니다.
   메모: 튜브에서 기포는 전기 생리학적 기록을 강력하게 방해하므로 완전히 제거하십시오.
5. ~3ml/min flow.
   를 달성하도록 압력을 조정합니다. 메모: 높은 압력은 조직 절편의 움직임과 전기생리학적 기록의 종결을 유발합니다.
6. VNO 슬라이스를 이미징 챔버로 전송하고 0.1mm 두께의 합성 섬유로 배선된 스테인리스강 앵커를 사용하여 슬라이스 위치를 고정합니다(그림 2B-C).
   메모: 조직 슬라이스를 합성 섬유 실 중 하나로 덮지 말고 슬라이스를 둘러싼 아가로스를 덮으십시오.
7. 이미징 챔버를 레코딩 설정으로 전환하고 수조 애플리케이션을 통해 실온에서 산소가 공급된 S₂로 슬라이스를 지속적으로 슈퍼퓨즈합니다.
8. 용액 표면에 대한 흡입 모세관을 조정하여 수조 용액의 지속적인 교환을 위해 느린 흡입을 생성합니다. 8-in-1 다중 배럴 "관류 연필"을 혈관이 포함된 VNO 슬라이스의 비감각 부분에 가깝게 조정합니다(그림 2C, 3A). 관류 연필과 기록 피펫을 반대 방향에서 슬라이스를 향하도록 배치하는 것이 좋습니다.
9. L자형 한천 브리지(150mM KCl로 채워짐)를 사용하여 기준 전극과 수조 용액을 연결합니다.
10. 패치 피펫에 피펫 용액 S₄를 채웁니다.
11. 코팅을 긁어내지 않고 헤드 스테이지에 연결된 은염화물 코팅 패치 전극 위에 피펫을 장착하고 단단히 부착합니다.
12. 수조에 들어가기 전에 패치 피펫에 약간의 양압(10ml 플라스틱 주사기에 약 1ml)을 가합니다.
13. 대물렌즈에 부딪히지 않고 물에 잠길 수 있을 만큼 충분히 멀리 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 수조로 내립니다(그림 2D).
14. 헤드 스테이지에 연결된 전기생리학 소프트웨어를 사용하여 피펫 저항(R_pip, 4-7 MΩ 사이)을 모니터링합니다.
    메모: R_pip가 <4MΩ이면 유리 팁이 깨진 것입니다. R _pip가 >10MΩ인 경우 팁이 막혔을 가능성이 높으므로 파이펫을 교체해야 합니다.
15. 적외선에 최적화된 미분 간섭 대비(DIC)를 사용하여 CCD 카메라로 VNO 슬라이스를 시각화하고 형광 조명과 적절한 필터 큐브를 사용하여 세포(또는 유사하게 라벨링된 뉴런)를 발현하는 FPR-rs3-i-Venus(FPR-rs3: 포르밀 펩타이드 수용체 관련 시퀀스 3)를 식별합니다.
16. 실험 설계에 따라 형광 또는 비형광 세포에 초점을 맞추고 표적화합니다.
17. 세포체에 접근하려면 최대 감도를 위해 핸드 휠을 사용하십시오. 양압으로 인해 세포 소세포막의 작은 움푹 들어간 곳이 피펫 팁이 가까이 오면 보이게 됩니다.
18. 양압을 해제하고 약간의 음압을 가하여 세포막을 빨아들여 높은 저항 밀봉(1-20 GΩ)을 얻습니다. 짧고 부드러운 흡입을 가하여 세포막을 파괴하고 전체 세포 구성을 확립합니다.
19. 실험 중 접근 저항을 지속적으로 모니터링합니다.
    메모: 작고 안정적인 접근 저항(R_입력의 ≤3%, 실험 과정에서 <20% 변화)을 보이는 뉴런만 분석에 포함합니다.

결과

그림 1: VNO의 해부. (A) 앞니가 절단되는 위치와 각도를 보여주기 위해 마우스 머리의 측면도. (B) 상부 입천장을 잡고 벗겨낼 수 있는 가장 좋은 지점을 묘사하는 복부 보기(UP). (C) 아래턱, 앞니 및 입천장을 제거한 후 VNO와 보머 뼈(VB)를 품고 있는 연골낭(CC)에 대한 복부 보기. (D) 두 VNO의 양측 국소화를 묘사하는 절개된 VNO 캡슐의 등쪽 모습(D_{, i}). 측면도는 두 VNO를 분리해야 하는 등쪽 연골의 가장자리를 보여줍니다(D_ii). 축척 막대 = 1mm(

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
화학 물질
아가로스(저겔화 온도)	페크랩	2030년 35월
ATP (Mg-ATP)	시그마-알드리치	A9187
비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES)	시그마-알드리치	B9879
염화칼슘	시그마-알드리치	C1016
에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA)	시그마-알드리치	E3889
포도당	시그마-알드리치	G8270
GTP(나-GTP)	시그마-알드리치	51120
(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)	시그마-알드리치	H3375 (영문
염화마그네슘	시그마-알드리치	M8266
염화칼륨	시그마-알드리치	P9333
수산화칼륨	시그마-알드리치	3564
소금	시그마-알드리치	S7653
탄산수소나트륨	시그마-알드리치	S5761
수산화나트륨	시그마-알드리치	S8045
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작은 페트리 접시, 35mm	폭스바겐		VNO 해부용 뚜껑, 아가로스에 삽입하기 위한 접시
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증폭기	HEKA 일렉트로닉	EPC-10
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CCD 카메라	라이카 마이크로시스템즈	DFC360FX
필터 큐브, 여기: BP 450-490, 억제: LP 515	라이카 마이크로시스템즈	나3
형광 램프	라이카 마이크로시스템즈	EL6000
열판 자석 교반기	스나이더스	34532
마이크로포지	나리시게	MF-830
마이크로 매니퓰레이터 장치	루이그스 & 노이만	SM-5
마이크로 피펫 풀러, 수직 2단	나리시게	PC-10
현미경	라이카 마이크로시스템즈	CSM DM 6000 SP5
노이즈 제거기 50/60Hz(HumBug)	퀘스트 사이언티픽
목표	라이카 마이크로시스템즈	HCX APO L20x/1.00W
오실로스코프	텍트로닉	TDS 1001B
삼투압계	고노텍	오스모맷 030
관류 시스템 8-in-1	오토메이트 사이언티픽
pH 측정기 5 easy	메틀러 톨레도
피펫 보관 용기	세계적인 정밀 기기	212회
녹음실	루이그스 & 노이만	Slice 미니 챔버
면도날	윌킨슨 소드 GmbH	윌킨슨 소드 클래식
산소화 슬라이스 저장 챔버; 대안적인 상업용 챔버는 예를 들어 BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) 또는 Pre-chamber (BSC-PC; 워너 인스트루먼트)	맞춤 제작
실체 현미경	라이카 마이크로시스템즈	시즌 4E
트리거 인터페이스	HEKA 일렉트로닉	TIB-14 에스
비브라톰	라이카 마이크로시스템즈	VT 1000 S
수조	멤메르트	WNB 45