억제성 신경전달물질 차단제가 있는 상태에서 깨어 있는 쥐의 청각 신경 반응 조사

초록

출처: Ayala, Y. A., et al. 깨어 있는 쥐에서 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 적용과 결합된 신경 활동의 세포 외 기록. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 청각 자극을 처리하는 마우스 뇌의 특정 영역에서 신경 세포 활동에 대한 연구를 보여줍니다. 이 기술은 억제성 신경 전달 차단제를 적용하고 약물이 국소 뇌 영역에 적용되기 전과 후의 청각 자극에 대한 신경 반응을 비교하는 것을 포함합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마이크로이온 영동용 약물

참고: 마이크로이온 영동에 사용되는 약물은 물에 용해될 때 전하가 있어야 합니다. 관심 약물이 이 절차에 적합한지 문헌을 확인하십시오. 여기에서는 GABA_A 수용체의 길항제인 가바진(gabazine)에 대한 시술이 설명된다.

1. 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 증류수를 여과하여 살균하고 용질이 포함되어 있지 않은지 확인합니다. 이 증류수를 사용하여 ~1,000μl의 20mM 가바진을 준비합니다.
2. 미세 팁 pH 전극을 사용하여 0.2μm 여과된 NaOH로 희석액의 pH를 4로 조정합니다.
3. -20ºC에서 100 - 200 μl 분취액을 보관하고 기록 당일에 해동합니다. 그날, 동물을 구속하기 전에 유연한 플라스틱 바늘이 장착된 100μl 마이크로 주사기를 사용하여 다중 배럴 전극의 배럴(3 - 5 μl)에 약물을 채웁니다.

2. 수술 및 헤드포스트 이식

1. 27g 및 30g의 무게를 가진 두 마리의 수컷 CBA/J 마우스(Mus musculus)에서 실험을 수행합니다.
2. 수술 전 며칠 동안 동물을 다루고 녹음실을 자유롭게 탐험하여 익숙해질 수 있도록 합니다. 하루에 3회씩 3회 수행하며, 각 세션은 최소 30분 동안 지속됩니다. 이렇게 하면 녹음하는 동안 그들을 진정시키고 편안하게 만들 것입니다.
3. 근육 주사로 케타민(50mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 혼합하여 마우스를 마취합니다. 이 용량은 약 1시간 동안 동물을 깊이 마취시킵니다. 필요에 따라 초기 용량의 1/3을 보충 투여합니다.
4. 38°C ± 1°C의 온도를 유지하도록 설정된 가열 담요 위에 동물을 놓고 두 개의 이어바와 바이트 바를 사용하여 동물의 머리를 입체 프레임으로 고정합니다. 이어바로 고막을 뚫지 않도록 주의하세요.
5. 안과 젤 한 방울을 바르고 눈을 보호하십시오.
6. 가위를 사용하여 두피를 면도하고 포비돈 요오드를 바르면 피부가 소독됩니다.
7. 메스를 사용하여 정중선을 따라 절개하여 두개골을 드러내고 두정골과 후두골의 더 많은 상부 부분을 덮고 있는 골막을 후퇴시킵니다.
8. 두개골에 둥글고 평평한 바닥(직경 5mm)이 있는 경량 두랄루민 헤드포스트(무게 ~0.65g, 길이 30mm, 그림 1A)를 붙입니다. 머리 기둥 중앙에 은색 와이어를 붙여서 끝을 자유롭게 만듭니다. 은선은 전기생리학적 기록을 위한 기준 전극으로 사용됩니다.
9. 두개골과 헤드포스트 바닥에 광경화 접착제를 얇게 바르십시오. 10초 동안 기다렸다가 정중선을 따라 두정골의 상부 부위에 헤드포스트를 놓습니다.
10. 효과적인 접착 강도를 위해 청색 광원을 사용하여 접착제를 20초 동안 광 경화합니다.
11. 전기 드릴과 작은 드릴 비트를 사용하여 헤드포스트 바닥 주변과 뒤에 세 개의 구멍을 뚫습니다.
12. 천공된 구멍에 두 개의 시계 나사(~2mm 길이)를 놓아 두개골과 헤드 사이의 추가 접점 역할을 합니다.tage. 나사는 꼭 맞도록 11/2 회전이 필요합니다. 집게로 나사를 테스트하여 느슨하지 않은지 확인하십시오.
13. 은색 접지선의 끝을 세 번째 구멍에 삽입하여 경막에 닿도록 합니다. 방수 시아노아크릴레이트 접착제를 한 방울 떨어뜨려 와이어를 두개골에 묶습니다.
14. 두개골과 헤드포스트의 결합을 강화하기 위해 광경화 복합재를 적용합니다. 헤드포스트의 바닥, 은색선의 아래쪽 부분, 나사를 덮고 녹음 중 접근을 허용하기 위해 람다 뒤로 확장되지 않도록 주의하십시오. 청색광을 사용하여 경화합니다.
15. 두개골에 삽입되는 목 뒤쪽의 근육을 수축시킵니다. 작은 트레핀(직경 2.35mm)을 사용하여 람다 봉합사 바로 아래와 정중선 측면에 둥근 창을 뚫어 하구(IC)를 노출시킵니다. 테두리가 느슨해지면 가는 핀셋으로 덮고 있는 뼈를 위로 당깁니다. 출혈이 발생하면 차가운 멸균 식염수로 헹구어 멈춥니다.
16. 복합재를 사용하여 창 주위에 작은(~1mm 너비, ~1mm 높이) 벽을 만들고 광경화합니다.
17. 노출된 두개골과 근육을 항생제 연고로 덮는다. 그런 다음 IC의 노출된 표면을 멸균 식염수로 적시고 바셀린으로 덮고 기록 창 주위에 벽을 만든 후 생성된 우물을 채웁니다.
18. 부프레노르핀을 진통제로 피하주사(0.03mg/kg, 멸균 식리수에 1:10 희석)합니다.
19. 동물이 깨어날 때까지 난방 담요 위에 동물을 두었다가 3일 동안 수술 후 회복할 수 있도록 케이지로 되돌려 보낸 후 세션을 녹음합니다. 개별 쥐의 사육 케이지에 동물을 수용하여 케이지 메이트가 젤리와 머리 기둥이 금속 격자 덮개에 닿는 것을 청소하지 못하도록 합니다. 동물이 독실로 있을 때 케이지에 약간의 농축물을 넣으십시오. 또한 감염을 예방하기 위해 매일 톱밥을 갈아주고 동물이 제대로 회복하고 불편한 징후를 보이지 않는지 주의 깊게 확인하십시오. 또한 노출된 뇌를 보호하는 녹음 창 위에 바셀린이 있는지 확인하십시오.

3. 전기생리학적 기록과 미세이온영동

1. 회복 후에는 동물이 녹음 환경에 적응할 시간을 주고 머리를 고정시킵니다. 쥐가 몸 크기에 맞게 조각된 맞춤형 쿠션 폼 구속기 위에 앉아 있는 동안 헤드포스트를 홀더에 고정하여 동물을 적응시킵니다(그림 1B). 이것은 마우스의 움직임을 제한하고 침착함에 기여합니다.
2. 10분 세션으로 시작하여 최대 120분까지 점진적으로 기간을 늘립니다. 세션 동안 주어진 간격으로 동물에게 달콤한 액체(연유, 물에 30:70으로 희석)를 보상합니다. 나중에, 녹음 세션 중에 세션 시작과 끝 시 또는 뉴런이 분리되지 않은 동안 동일한 보상을 제공하십시오.
3. 기록 전에 동물이 흥분한 경우 약한 진정제 아세프로마진(2mg/kg, 복강내)을 주사합니다. 관심 있는 신경계에 따라 진정제는 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.
4. 동물이 5-10분 동안 녹음실을 자유롭게 탐색하게 합니다.
5. 동물의 몸을 폼 맞춤형 쿠션 구속기에 넣습니다(그림 1B).
6. 정위 프레임에 부착된 홀더에 헤드포스트를 고정합니다(그림 1C). 이것은 동물에게 액체 보상을 주기에 좋은 시기입니다.
7. 동물의 몸을 면 담요로 덮고 플라스틱 반실린더와 접착 테이프를 사용하여 느슨하게 고정합니다.
8. 녹음 창에서 바셀린을 제거하고 따뜻한 멸균 식염수로 헹굽니다.
9. 신경 활동 및 가바진의 이온 영동 적용을 기록합니다.
   1. 멀티배럴 전극을 홀더에 놓고 마이크로드라이브로 제어하고 마이크로매니퓰레이터에 부착합니다.
   2. 작은 악어 클립을 사용하여 녹음할 와이어를 연결합니다. 양극 단자를 텅스텐 전극의 끝에 연결하고 접지 단자를 듀라와 접촉하는 은선에 연결합니다.
   3. 각 배럴 내부에 코팅되지 않은 은선을 배치하여 한쪽 끝이 용액에 닿고 다른 쪽 끝이 접근할 수 있도록 합니다. 제조업체의 지침에 따라 해당 끝을 microiontophoresis 장치에 연결합니다.
   4. 팁이 뇌 표면에 닿을 때까지 멀티배럴 전극을 움직입니다. 뇌 조직의 건조를 방지하기 위해 따뜻한 멸균 식염수를 바르십시오. 이 시점에서 보유 전류(가바진의 경우 -10nA, 특정 약물에 대한 문헌 확인)를 적용하여 단일 장치 활성을 찾는 동안 배럴 팁에서 약물이 누출되는 것을 방지합니다.
   5. 단일 뉴런 세포 외 활동을 분리하기 위한 표준 기술을 사용합니다. 뉴런의 주파수 응답 영역(FRA), 즉 뉴런이 이러한 소리에 민감하기 때문에 반응을 유발할 수 있는 주파수와 강도의 조합을 구합니다.
   6. 유사한 발사 속도와 패턴을 유발하는 두 개의 주파수(f1 및 f2)를 선택합니다. 이러한 각 주파수를 괴짜 패러다임 아래에서 드물고 반복적인 자극으로 제시합니다.
      메모: 간단히 말해서, 괴짜 패러다임에서 하나의 주파수(f1)는 발생 확률이 높은 반복적인 자극으로 제시되는 반면, 두 번째 주파수(f2)는 드물게 발생하는 일탈 자극으로 반복되는 자극 사이에 무작위로 산재되어 있습니다. 두 번째 홀수 시퀀스에서는 두 자극의 상대 확률이 역전됩니다.
   7. 전류를 양수 값(10 - 20 nA)으로 이동하여 가바진을 해제합니다. FRA를 다시 얻고 gabazine 응용 프로그램에서 oddball 패러다임을 반복합니다. 발사 속도에서 눈에 띄는 효과가 관찰될 때까지 배출을 유지하십시오. 일반적으로 5 - 20분 정도 소요되며, 특정 약물, 농도 및 배출 전류의 크기에 따라 다릅니다. 약물의 효과에 따른 값을 얻기 위해 기록 프로토콜을 반복합니다.
   8. 전류를 보존 값으로 되돌려 주입을 중지합니다. FRA 또는 괴짜 패러다임에 대한 반응이 제어 값으로 돌아가는지 여부를 모니터링하여 약물의 효과가 씻겨 나갈 때까지 기다립니다.
      메모: 녹음 세션은 하루에 2-3시간 동안 지속될 수 있으며 동물이 불편함이나 몸부림의 징후를 보이면 더 일찍 끝내야 합니다. 액체에 대한 보상을 주고 녹음 챔버를 바셀린으로 덮습니다.

결과

그림 1. Awake Mice 녹음용 액세서리. (A) 헤드포스트. (B) 맞춤형 쿠션 폼 구속기. 두 조각 사이에 마우스를 놓고 머리는 바깥쪽으로 둡니다. (C) 입체성 프레임에 대한 수정. 헤드포스트 홀더(상단 바)는 헤드포스트 이식 중에 보조하고 녹음하는 동안 머리를 고정합니다. 교합 부위(하단 막대)는 헤드포스트 이식 중에만 사용됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
텅스텐 와이어	하버드 장치 LTD	Tel.: 33-0099	0.005인치 x 3인치
붕규산 유리 모세관	하버드 장치 LTD	Tel.: 30-0053	필라멘트가 없는 붕규산 표준 벽, 1.5mm OD, 0.86mm ID, 100mm 길이
멀티배럴 유리 모세관	세계적인 정밀 기기	5B120F-4	5배럴 모세관, 길이 4인치, 1.2mm OD, 필라멘트 포함
다이아플러스	다이아덴트	2001-2101	광경화 접착제, 텅스텐 전극을 glas multibarrel 피펫에 부착하는 데 사용됩니다.
G-본드	주식회사(주)GC	2277	동물의 두개골에 헤드포스트를 부착하는 데 사용되는 광경화 접착제
카리스마	헤레우스 쿨처	66000087	두개골과 헤드포스트의 결합을 강화하는 데 사용되는 광경화 복합재
아랄디트 크리스탈	세이		2 성분 expoxy, 텅스텐 전극을 유리 멀티 배럴 피펫에 추가로 고정하는 데 사용됩니다
난방 담요	시버텍	RTC1
Stereotactic 프레임	나리시게	SR-6N	마우스용으로 수정됨
Microiontophoretic 장치	하버드 장치 LTD	뉴로포어 BH-2	IP-2 이온영동 펌프(각 약물 전달 채널당 1개) 및 밸런스 모듈 포함
Multibarrel 유리 피펫 풀러	나리시게	모델: PE-21
LED 램프	테크노플럭스	이력서-215	5W, 430-485nm
마이크로필	세계적인 정밀 기기	MF34G-5	유연한 플라스틱 바늘, 34AWG
이말게네	메리알		케타민, 100mg/mL
롬푼	바이엘		자일라진, 20 mg/mL
가바진 / SR-95531	시그마	시즌 106	증류수에 ~ 1000μl의 20mM 가바진을 준비하고 pH를 4로 조정합니다.

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