Neuron-Astrocyte 공동 배양에서 Neuronal Network의 전기생리학적 활동 기록

초록

출처: Taga, A., et al. 지역별 인간 만능 줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 뉴런 네트워크 활동을 기록하기 위한 뉴런-성상세포 공동 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. MEA(Multi-electrode Array) 플레이트에서 운동 뉴런과 성상세포의 공동 배양을 확립한 후, MEA를 사용하여 뉴런 네트워크의 동기 리듬 전기 활동을 세포 외로 기록했습니다.

프로토콜

1. 다중 전극 어레이 플레이트에서 MN 및 척수 성상 세포를 공동 배양

1. 운동 뉴런과 성상세포를 당일에 사용할 준비가 되면 구별하고 플레이트를 만듭니다(운동 뉴런의 경우 DIV: 60, 성 상세포의 경우 DIV 90
).
2. 24웰 플라스틱 플레이트로 작업하는 경우 다음과 같이 도금 전날 또는 당일에 MEA 플레이트를 코팅합니다(재료 표).
3. 폴리오르니틴(PLO)을 물 또는 인산염 완충 식염수(PBS)에 100μg/mL로 희석합니다.
   1. 각 웰에 15-20 μL를 추가하여(파이펫 편안함 수준에 따라 다름) 웰 중앙에 액적을 형성하여 전극 영역과 주변 영역을 덮지만 웰 전체는 포함하지 않습니다.
   2. 피펫 팁으로 전극이 손상되지 않도록 주의하십시오. 각 웰에서 동일한 표면적의 적용 범위를 보장하기 위해 웰에서 웰까지의 부피와 일관성을 유지해야 합니다.
   3. PLO를 37 ° C에서 최소 1 시간 (바람직하게는 2 시간) 동안 배양하십시오 .
      메모: 작은 부피는 플레이트에 충분한 습도가 없으면 건조됩니다. 우물을 둘러싼 구획에 물을 추가하여 코팅 및 기록 과정 전반에 걸쳐 충분한 습도를 확보하십시오.
4. 플라스틱 마이크로피펫 팁을 사용하여 가능한 한 많은 PLO를 흡입합니다. 전극을 만지지 않도록 주의하십시오. 250μL의 물로 세 번 씻습니다. 세척을 위해 진공 흡입기를 사용하는 경우 전극 어레이 근처에 팁을 두지 마십시오. 세 번째 세척 후 필요에 따라 피펫 팁을 사용하여 가능한 한 많은 물을 제거하십시오. 뚜껑을 제거한 상태에서 세포 배양 후드 아래에서 표면을 건조시킵니다.
5. 플레이트 표면이 건조되면 PBS에서 10μg/mL로 희석된 라미닌을 첨가합니다. 15-20 μL를 사용하여 각 전극 어레이를 덮습니다. 습도 칸에 물을 추가하고 뚜껑을 다시 덮은 다음 플레이트를 최소 37시간에서 하룻밤 동안 2°C 배양으로 되돌립니다.
6. 도금 당일, 배양된 운동뉴런(MN)과 성상세포를 PBS로 한 번 헹구고 37°C에서 트립신 0.05%를 첨가하여 세포를 들어 올립니다(5분). 트립신 억제제가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 모으고 배지 또는 염기로 플레이트를 세척하여 모든 세포가 수집되었는지 확인합니다. 300 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 1000μL 피펫으로 재현탁하여 1mL의 단일 세포 현탁액을 생성합니다. MN 및 성상세포를 재현탁하는 경우, 20μM Rho-associated coiled-coil forming protein serine/threonine kinase inhibitor(ROCK-I)를 추가하여 공동 배양 배지(표 1)로 전환합니다.
7. 혈구계를 사용하여 MN과 성상세포를 병렬로 계수합니다. 계수하고 계산하는 동안 셀 현탁액을 덮고 4°C의 스티로폼 랙에 놓습니다.
8. 배양물을 5 x 10, 운동 뉴런의 경우 5μL당⁴개 세포, 성상세포의 경우 5μL당 4개 세포, 성상세포의 경우 2.5 x 10, 5μL당⁴개의 세포 농도로 재현탁하는 데 필요한 부피를 계산합니다. 1mL 세포 현탁액을 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고 계산된 부피로 재현탁합니다.
9. 파종할 원하는 웰의 수를 계산하고 각 세포 현탁액의 5μL를 곱합니다. 필요한 양의 뉴런 및 성상세포 현탁액을 1:1 비율로 결합하고 완전히 결합될 때까지(보통 2회) 피펫팅으로 혼합하되 너무 공격적인 것은 피하십시오.
10. 피펫 팁을 사용하여 MEA 플레이트의 각 웰에서 라미닌을 제거합니다. 최종 결합 세포 현탁액 10μL를 각 웰로 전달하여 전극 어레이를 덮는 작은 액적을 형성하여 웰당 5 x 10^4MN 및 2.5 x 10⁴ 성상세포의 세포 밀도를 제공합니다.
    메모: 결합된 현탁액의 세포 밀도가 높으면 정확하고 일관된 세포 계수를 보장하기 위해 파종 단계 동안 웰 사이에 빈번한 재현탁이 필요합니다.
11. 플레이트를 20-30분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 세포 방울을 방해하지 않도록 주의하고 세포가 플레이트에 초기 부착물을 형성할 수 있도록 합니다.
12. 20-30분 후, 각 웰의 벽에 250μL를 피펫팅하여 각 웰에 따뜻한 공동 배양 배지 + ROCK-I를 추가한 다음 반대쪽에 있는 동일한 웰의 벽을 250μL 더 아래로 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
13. 파종 다음 날(공동 배양 1일차)에 플레이트를 검사합니다. 상당한 세포 파편이나 죽은 세포가 있는 경우 배지를 ROCK-I를 함유한 새로운 공동 배양 배지로 교환합니다. 그렇지 않으면 파종 후 2일차(Co-Culture Day 2)에 배지를 ROCK-I가 없는 공동 배양 배지로 변경합니다. 일주일에 두 번 반중간 교환(50% 흡인 및 증발을 설명하기 위해 최종 부피의 60% 추가)을 수행합니다.
14. 단일 웰 30mm 유리판(재료 표)이 있는 MEA 시스템을 사용하는 경우 플레이트 준비에 2일 이상이 소요될 수 있습니다. 이 작업을 수행하려면 아래 단계를 따르십시오.
15. 이전 MEA 배양에서 0.05% 트립신으로 5-15분 동안 세포와 세포 파편을 들어 올립니다.
16. 트립신을 흡입하고 물로 3회 헹굽니다.
17. 70% 에탄올을 첨가하여 살균하고 후드에서 10분 동안 배양합니다. 에탄올을 흡입한 다음 물로 세 번 헹굽니다.
18. 프로테아제 효소와 함께 1% 음이온성 세제를 물에 도포합니다. 접시를 뚜껑으로 덮고 열가소성 필름과 알루미늄 호일로 감싼 다음 실온의 로커에 밤새 그대로 두십시오.
19. 세제를 흡입한 다음 물로 세 번 헹굽니다.
20. 접시를 보관할 계획이라면 충분한 양의 물을 추가하십시오. 접시를 뚜껑으로 덮고 열가소성 필름과 알루미늄 호일로 싸서 다음에 사용할 때까지 냉장고에 두십시오.
21. 코팅을 계획하고 있다면 세포 배양 후드 아래에서 표면을 건조시키십시오.
22. 추가 살균이 필요한 경우(예: 이전 감염 또는 최근에 사용하지 않은 사용) 이 시점에서만 MEA 플레이트를 후드 아래의 자외선(UV)에 30-60분 동안 노출하십시오.
    메모: 잦은 자외선을 피하면 전극의 손상을 방지할 수 있습니다. 플레이트에 세럼이 있을 때 자외선을 사용하면 전극이 작동하지 않게 되므로 세척된 플레이트에만 사용해야 합니다.
23. 플레이트가 완전히 건조되면 1분 동안 플라즈마 세척을 진행하여 MEA 플레이트의 유리 표면을 충전하고 코팅 효과를 높입니다. MEA 플레이트 세척-도금 주기의 4-5주기마다 적어도 한 번씩 플라즈마 청소.
    1. 대안으로, 혈장 세척이 불가능하거나 보증되지 않는 경우 MEA 플레이트의 표면을 덮을 수 있는 충분한 양의 소 태아 혈청(FBS) 함유 배지를 추가하고 밤새 인큐베이터에 다시 넣습니다.
24. PLO(폴리오르니틴)/라미닌 코팅을 사용합니다. 플라즈마 세척 또는 흡인 및 FBS 함유 배지를 헹구어 낸 직후 PLO 용액(PBS의 100μg)을 추가합니다.
25. 1 x 10⁵ 인간 만능 줄기 세포 유래 성상 세포(hiPSC-A)/플레이트 및 5 x 10⁵ 인간 만능 줄기 세포 유래 운동 뉴런(hiPSC-MN)/플레이트
.

2. 다중 전극 어레이 레코딩

1. 200Hz 고역 통과 필터와 3kHz 저역 통과 필터가 있는 버터워스 필터를 사용하여 12.5kHz 샘플링 주파수에서 원시 전압 데이터를 추출합니다. 스파이크 인식을 전압의 순간 시점으로 설정합니다 ≥기준선에서 6 표준 편차. 버스트를 100ms에 >5개의 스파이크가 있는 활동으로 식별합니다. 전체 활성 전극의 35% 이상이 100ms 이내에 발사되고 네트워크 버스트당 최소 50개의 스파이크가 발생할 때 네트워크 활동을 정의합니다.
2. Co-Culture (CC) Day 1 이후 가능한 한 빨리 녹음을 시작하십시오.
   메모: CC 3일차 이전에는 전기 활동이 거의 나타나지 않습니다.
3. 유사한 밀도의 플레이트 병렬 배양 및 생화학 분석, 면역세포화학(ICC) 또는 정량적 PCR(qPCR)을 위한 적절한 배양 플레이트 또는 커버슬립에서 복제합니다.
4. 온도를 37°C로 설정하고 CO₂를 5%로 설정하여 기록을 수행합니다. 플레이트를 기계로 옮기고 기록하기 전에 최소 5분 동안 평형을 이루도록 합니다.
5. 실험 설계에 따라 1-15분 동안 격일 또는 매주로 기준선 활동을 기록합니다. 매체 교환 후 최소 1시간 동안 녹음하지 말고, 모든 미디어 교환 후 24시간 동안 기다리는 것이 좋습니다.
6. 오염을 방지하려면 멸균 플레이트의 뚜껑을 멸균 후드 외부에서 열어야 하는 경우(즉, 약물 화합물 도포) 후 배지를 변경(즉, 1.14단계와 같이 절반 배지 교환)하십시오. 플레이트가 약물 치료 이후에도 계속 사용될 경우 약물을 씻어내기 위해 완전한 매체 교환 및 세척을 수행합니다.
7. 분석을 위해 각 조건에 대해 최소 3개의 기술 및 생물학적 복제물을 사용합니다. 전기생리학적 데이터를 n ≥ 3회 반복의 수단으로 표현합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 멸균 배양 플레이트	송골매	353003
25cm멸균 배양 플라스크 2개	송골매	353136
500 mL 0.2 μm CA 필터 시스템	코 닝	430769
5 mL 피펫	송골매	357543
6 잘 멸균 배양 플레이트	송골매	3046
Axion CytoView MEA 24 플레이트(M384-tMEA-24W)	액시온	옵션-24
Axion Edge MEA 플랫폼	액시온	마에스트로 엣지
기저막 매트릭스 - Matrigel	코 닝	354277	프로토콜의 세부 정보
탁상형 현미경(멸균 세포 배양 후드 아래)	자이스	415510-1100-000	프리모 베르트
섬모 신경 영양 인자(CNTF)	페프로텍	450-13	100μg을 멸균 PBS 1mL에 용해시킨 다음 멸균 0.1% BSA-PBS 9mL를 10μg/mL에 첨가합니다. -80ºC에서 분취 및 동결. 사용을 위해 1 : 1000에서 희석하십시오. (작업 농도 10ng/mL).
CO2 탱크 및 레귤레이터 Axion Edge용	에어가스/해리스	9296NC
DMEM/F12	써모피셔	113300	작업 집중 1x
에센셜 8 미디엄 + 에센셜 8 보충제	써모피셔	A1517001	에센셜 8(10x) 보충제 10mL와 에센셜 8 성장 배지 500mL(1개)를 함께 섭취하십시오.
소 태아 세럼(FBS)	써모피셔	16140071	작업 집중 1x
혈구계	선거 현미경 과학	63510-20
습도 조절식 세포 배양 인큐베이터	써모피셔	370	37ºC, 5% CO2로 설정
라미닌	써모피셔	23017-015	원액 1 mg/mL, 작업 농도 10 μg/mL(코팅), 1 μg/mL(세포 매체)
L-글루타민	써모피셔	25030	LDN 2mg을 클로로포름 500μL에 용해시켜 10mM 스톡을 얻습니다. 이것을 분주하고 -80ºC에서 동결합니다. 사용을 위해 먼저 원액 1-10을 DMSO[1mM]로 희석한 다음 1mM의 1:5000을 원하는 매체에 희석하여 0.2μM 작업 용액을 얻습니다.
MEA 유리판	멀티채널 시스템	60MEA200/30iR-티-GR	작업 농도 100x
멀티채널 피펫 P200	길슨	PJ22224
뉴로기저	써모피셔	21103049
비필수 아미노산(NEAA)	써모피셔	11140050	작업 집중 1x
펜슬린/스트렙토마이신	써모피셔	15140122	작업 농도 100x
폴리오르니틴(PLO)	시그마-알드리치	P3655	작업 농도 100x
염화칼륨 (KCl)	해당 없음	해당 없음	ddW 1mL에 100mg을 녹여 100mg/mL 원액을 얻습니다. 100 μL 튜브에 스톡을 분주합니다. (작업 농도 100 μg/mL)
푸르모르파민(PMN)	밀리포어-시그마	540223	작업 농도100 mM
ROCK-억제제	페프로텍	1293823	재구성 전 잠시 원심분리기. PBS 1mL에 100μg을 100μg/mL로 용해한 다음 멸균 0.1% BSA-PBS 9mL를 10μg/mL에 첨가합니다. -80ºC에서 분취 및 동결. 사용을 위해 1 : 1000에서 희석하십시오. (작업 농도 10ng/mL).
멸균 세포 배양 후드	베이커 컴퍼니	SG-600	1480μL의 dH2O에 5mg을 용해시켜 10mM 스톡을 얻고 분취 및 -80ºC에서 동결합니다. 1:500으로 희석하여 사용합니다. (작업 농도 20 μM).
보충제 B - B27 보충제	써모피셔	21985023
탁상용 세포 배양 원심분리기	써모피셔	75004261	작업 농도 50x
열가소성 필름 - 파라필름	파라필름	P7793	소르발 레전드 X1R
트립신-EDTA (0.05%)	써모피셔	2530054	작업 집중 1x
물목욕	써모피셔	2332	아이소템프