Simultaneous Measurement of Intracellular calcium and Membrane Potential in a Mouse Cerebral Endothelium(쥐 대뇌 내피에서 세포 내 칼슘 및 막 전위)

초록

출처: Hakim, M. A. et al. 갓 분리되고 손상되지 않은 마우스 대뇌 내피에서 세포 내 칼슘 및 막 전위의 동시 측정. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 쥐의 대뇌 동맥 분절의 내피 세포에서 세포 내 칼슘 수치와 막 전위의 변화를 동시에 측정하는 것을 보여줍니다. 분리된 내피관에는 형광 칼슘 지시약이 적재되어 세포 내 칼슘 방출을 유도하는 약물로 처리되어 막 전위의 변화를 일으킵니다. 지표의 형광을 통해 칼슘 수치를 측정할 수 있으며, 기록 전극을 세포에 삽입하여 막 전위의 변화를 측정합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 대뇌동맥의 해부 및 격리

참고: 모든 해부 절차에는 실체 현미경과 광섬유 광원이 제공하는 조명을 통한 표본 확대(최대 50배)가 필요합니다. 뇌와 동맥을 분리하기 위한 해부 절차를 수행하려면 날카로운 해부 기구를 사용하십시오. 동맥을 분리하고 청소하기 위한 미세 해부 도구에는 날카롭고 끝이 가는 집게와 Vannas 스타일 해부 가위(3-9.5mm 날)가 포함됩니다.

1. 마우스 뇌의 분리
   1. C57BL/6 마우스(생후 3-30개월, 수컷 또는 암컷)를 이소플루란(2-3분 동안 3%)을 흡입하여 마취한 다음 완전한 마취 유도 후 즉시 동물의 목을 베십시오. 실체현미경으로 냉기(10°C) 영로 Ca²⁺ 생리적 염 용액(PSS)이 들어 있는 페트리 접시(직경 1.5cm, 깊이 4cm)에 머리를 놓습니다.
   2. 현미경을 통해 두개골 위의 피부와 머리카락을 제거하고 콜드 제로 Ca²⁺ PSS로 과도한 혈액을 제거합니다. 표준 박리 가위(예: 24mm 날)의 끝만 사용하여 후두골에서 시작하여 두개골의 코뼈까지 절개합니다.
   3. 끝이 굵은 집게를 사용하여 절개 부위를 따라 두개골을 조심스럽게 열고 결합 조직을 분리하여 온전한 Circle of Willis로 뇌를 분리합니다.
      참고: 또는 Littauer 뼈 절단 집게를 사용하여 두개골을 열고 뇌를 노출시킬 수 있습니다.
   4. 비이커에 콜드 제로 Ca²⁺ PSS로 고립된 뇌를 부드럽게 씻어 혈액을 제거합니다. 뇌동맥 분리를 위한 냉박리 용액이 들어 있는 챔버에 뇌 복부 쪽이 위를 향하도록 놓습니다(그림 1A).
2. 대뇌동맥 격리
   참고: 후뇌동맥은 이 프로토콜의 대표적인 뇌혈관 내피 연구 모델로 선정되었습니다.
   1. 유리 페트리 접시의 바닥(깊이 ≥50cm)을 코팅하는 숯이 주입된 실리콘 폴리머에 삽입하기 위해 스테인리스 스틸 핀(직경 0.2mm, 길이 ~11–12mm)을 사용하여 고립된 뇌를 냉간 해부 용액에 고정합니다.
   2. 해부 중 PSS의 냉각 온도를 유지하려면 1:1 물-에틸렌 글리콜 혼합물을 지속적으로 순환시키는 냉매 시스템으로 냉각된 해부 챔버를 사용하십시오. 또는 신선한 얼음에서 해부를 수행할 수 있습니다.
   3. 외과적으로 미세해부 기구, Vannas 스타일 가위 및 날카로운 끝이 가는 겸자를 사용하여 후방 통신 동맥 및 기저 동맥에서 후방 대뇌 동맥(~0.3 - 0.5cm 분절, 축 방향 장력 없음)을 격리합니다(그림 1B). 스테인리스 스틸 핀(직경 0.1mm, 길이 ~13–14mm)을 사용하여 페트리 접시의 해부 용액에 고립된 두 후방 대뇌 동맥을 고정합니다(그림 1C).
   4. 날카롭고 끝이 가는 집게를 사용하여 결합 조직을 제거하여 고립된 후방 대뇌 동맥을 조심스럽게 청소합니다(그림 1D). 효소 분해를 위해 온전한 동맥을 분절(길이 1-2mm)로 자릅니다(그림 1D, 삽입 사진).

2. 내피관과 과융합의 준비

1. 대물렌즈(10x, 20x 및 40x)가 장착된 현미경, 카메라, 챔버와 마이크로 매니퓰레이터가 있는 알루미늄 스테이지를 사용하여 trituration 장치를 준비합니다. s에 인접한 펌프 컨트롤러로 마이크로 주사기를 고정합니다.tage 및 표본(그림 2A).
2. trituration 피펫에 미네랄 오일을 완전히 채우고 마이크로 실린지 피스톤 위에 고정합니다. 그런 다음 펌프 컨트롤러가 있는 마이크로 주사기를 사용하여 피펫에 기포가 없는지 확인하면서 미네랄 오일 상단의 피펫(~130nl)으로 해리 용액을 회수합니다.
3. 0.31mg/mL 파파인, 0.5mg/mL 디티오에리스리톨, 0.75mg/mL 콜라겐분해효소 및 0.13mg/mL 엘라스타아제가 포함된 10mL 유리관(그림 2B)의 해리 용액 1mL에 온전한 동맥 분절을 놓습니다. 부분 소화를 위해 34 ° C에서 10-12 분 동안 배양하십시오.
4. 분해 후 효소 용액을 ~5mL의 신선한 해리 용액으로 교체하십시오. 1mL 피펫을 사용하여 실온(RT)에서 해리 용액이 들어 있는 챔버로 한 세그먼트를 옮깁니다.
5. 피펫을 챔버의 해리 용액에 넣고 분해된 용기의 한쪽 끝 가까이에 놓습니다. 부드러운 분쇄를 위해 펌프 컨트롤러에서 2-5nL/s 범위 내에서 속도를 설정합니다(그림 2C, 삽입 사진).
6. 100배에서 200배까지 확대하여 보면서 동맥 분절을 빼내고 배출하여 평활근 세포를 해리하면서 내피관을 생성합니다. 필요한 경우 끝이 가는 집게를 조심스럽게 사용하여 내피관에서 해리된 외막과 내부 탄성 얇은 판을 분리합니다. 모든 평활근 세포가 해리되고 내피 세포만 온전한 "튜브"로 남아 있는지 확인합니다(그림 2C).
7. micromanipulator를 사용하여 붕규산 유리 피핑 피펫을 사용하여 내피 튜브의 각 끝을 초융합 챔버의 유리 커버 슬립에 고정합니다(그림 2D).
8. 챔버에서 해리된 외막과 평활근 세포를 세척하고 해리 용액을 2mM CaCl₂ PSS로 교체합니다. 안전한 내피 튜브가 있는 모바일 플랫폼을 초융합 및 실험 장비의 현미경으로 옮깁니다.
9. 6개의 깨끗한 50mL 리저버(그림 3A)를 사용하여 실험 중 PSS 및 해당 약물 용액을 적절하게 지속적으로 전달합니다. 인라인 유량 제어 밸브를 사용하여 층류와 일치하는 동시에 유량 공급을 진공 흡입에 일치시키면서 전체 유량을 수동으로 설정할 수 있습니다. 백그라운드 데이터 및 염료 로딩을 기록하기 전에 ≥ 5분 동안 내피관의 과융합을 위해 PSS를 챔버(그림 3B)에 전달합니다.

3. 염료 부하, 세척 및 온도 설정

1. [Ca²⁺]_i를 측정하기 위해 측광 시스템의 모든 구성 요소를 켭니다. 실험용 장비(그림 3C)에서 현미경을 사용하여 400x 배율로 내피관을 보고 측광 시스템 소프트웨어 제품군을 사용하여 측광 창의 세포에 초점을 맞춥니다.
2. 내피관의 직경을 측정하고 340 및 380 nm(≥10 Hz)에서 교대로 여기하는 동안 510 nm 방출에 따라 배경 자가형광 값을 기록합니다.
3. 세포 내 Ca²⁺([Ca²⁺]_i) 반응을 측정하려면 RT에서 Fura-2 AM 염료(Fura-2-acetoxymethyl ester, 10μM 최종 농도)를 내피관에 로드하고 빛이 없는 상태에서 ~30-40분 동안 기다립니다.
4. 과도한 염료를 씻어내고 세포 내 Fura-2 AM이 탈에스테르화되도록 하기 위해 ~30-40분 동안 새 PSS로 내피관의 과융합을 다시 시작합니다. 세척 기간 동안 인라인 히터와 함께 온도 컨트롤러(그림 3A)를 사용하여 온도를 RT에서 37°C까지 점진적으로 올린 다음 실험 내내 37°C를 유지합니다.
   메모: RT에서 37°C까지의 권장 증분 전이는 각 단계에서 ≥5분의 평형 시간과 함께 3단계(예: 5°C)를 수반합니다.

4. _[Ca²⁺]i와 V_m의 동시 측정

1. 멤브레인 전위를 측정하기 위해 다른 모든 장비와 전위계 소프트웨어 제품군을 켭니다(Vm, 그림 3_, 그림 4 참조). 그에 따라 데이터 수집 속도를 조정합니다(≥10Hz).
2. 날카로운 전극을 당기고 2M KCl로 백필합니다. 염료 전달을 통한 세포 간 결합을 연구하려면 2M KCl에 용해된 0.1% 프로피듐 요오드화물로 미세 전극을 백필합니다.
3. 마이크로 매니퓰레이터로 고정된 전위계 헤드 스테이지에 부착된 피펫 홀더에 염화물로 코팅된 은색 와이어 위에 전극을 고정합니다. micromanipulator를 사용하여 전극 끝을 챔버의 흐르는 PSS에 잠시 배치하는 동안 view4x 대물렌즈를 통해 view.
4. 접지된 수조 전위와 일치하도록 휴지 V_m을 0으로 설정합니다. 전극 끝을 내피관의 세포 바로 위에 놓습니다. 원하는 경우 전위계에 연결된 가청 기준선 모니터를 사용하여 사운드 피치를 잠재적인 녹음과 연결합니다.
5. 40x 대물렌즈를 사용하여 배율을 400x로 늘리고 필요에 따라 전극 끝의 위치를 변경합니다. 측광 소프트웨어를 사용하여 측광 창을 조정하여 ~50-80개의 내피 세포에 초점을 맞춥니다.
6. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극을 내피관의 세포 중 하나에 부드럽게 놓고 휴지 V_m이 안정화될 때까지 ≥2분 동안 기다립니다. 유사하게, 제1 전극으로 찔린 첫 번째 셀로부터 다른 셀(거리 ≥100 μm)에 두 번째 전극을 삽입합니다.
7. 휴지_Vm이 예상 값(-30 - -40mV)에서 안정되면 빛이 없을 때 형광 계면의 PMT를 켜고 510nm에서 형광 방출을 수집하면서 340 및 380nm에서 교대로(10Hz) Fura-2를 여기하여 세포 내 [Ca²⁺]_i를 수집하기 시작합니다.
   참고 : 세포 간 전기 결합을 테스트하기 위해 전류 (± 0.5-3 nA, ~ 20 s 펄스 지속 시간)를 하나의 전위계를 통해 "Site 1"로 전달할 수 있으며 V_m의 변화를 다른 전위계를 통해 "Site 2"(거리 ≥100 μm)로 기록 할 수 있습니다.
8. V_m 및 [Ca²⁺]_i의 동시 측정이 설정되면 약물을 적용하기 전에 일정한 층류 속도로 내피관과 PSS의 과융합을 위해 ~5분을 허용합니다.
9. PSS에서 제조된 약물(예: 아데노신 삼인산[ATP])을 일정한 유속으로 초융합 챔버에 적용합니다. ~3분(또는 약물의 동역학에 적합한 기간)_{후 Vm과} F₃₄₀/F₃₈₀ 비율이 기준선 조건으로 돌아올 때까지 PSS로 세척합니다. 솔루션의 각 전환 중에 광도계 및 전위계 소프트웨어 제품군에서 각 기록을 일시적으로 동기화된 것으로 표시합니다.
10. 실험이 완료되면 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 셀에서 전극을 빼내고 수조 전극에서 참조하는 Vm ~0mV를 확인합니다. Vm_{, m} 및 [Ca²⁺]_i의 각 기록을 중지하고 데이터 분석을 위해 파일에 기록을 저장합니다.

결과

그림 1: 뇌에서 대뇌동맥의 분리.(A) 박리액에서 온전한 동맥(흰색 화살표는 후방 대뇌동맥을 나타냄)으로 분리된 뇌. (B) 후방 대뇌 동맥의 확대 보기 (흰색 화살표; ~3x vs.패널 A). (C) 표본 접시에 스테인리스 스틸 핀으로 고정된 고립된 후방 대뇌 동맥. (D) 결합 조직 제거 후 후방 대뇌 동맥. 삽입은 동맥의 절단된 부분을 보여줍니다. 스케일 바 = 500 μm

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
포도당	Sigma-Aldrich (미국 미주리주 세인트루이스)	G7021
염화나트륨	시그마	S7653
재질 보기 MgCl2	시그마	M2670
염화칼슘2	시그마	223506
헤페스	시그마	H4034
케이클	시그마	P9541
나오	시그마	S8045
ATP	시그마	A2383
염산(HCl)	ThermoFisher Scientific(미국 펜실베이니아주 피츠버그)	A466250
콜라겐 분해 효소 (H형 블렌드)	시그마	C8051
디티오에리스리톨	시그마	D8255
파파인	시그마	P4762
엘라스타제	시그마	E7885
증권 시세	시그마	A7906
프로피듐 요오드화물	시그마	P4170
디엠소	시그마	D8418
Fura-2 AM 염료	Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼즈배드	F14185
순환 냉각기 (Isotemp 500LCU)	써모피셔 사이언티픽	13874647
플렉시글라스 초융합 챔버	워너 인스트루먼트, 미국 코네티컷주 캠든	RC-27
유리 커버 슬립 바닥 (2.4 × 5.0 cm)	써모피셔 사이언티픽	12-548-5M
아노다이징 알루미늄 플랫폼(직경: 7.8cm)	워너 인스트루먼트	PM6 또는 PH6
소형 알루미늄 스테이지	Siskiyou, 그랜트 패스, 오리건, 미국	8090피
마이크로 매니퓰레이터	시스키유	MX10
실체현미경	자이스, 미국 뉴욕	Stemi 2000 & 2000-C
광섬유 광원	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	포스텍 8375
니콘 도립 현미경	Nikon Instruments Inc, 미국 뉴욕주 멜빌	TSS2
위상차 목표	니콘 인스트루먼트 Inc	(Ph1 DL, 10X 및 20X)
형광 대물렌즈	니콘 인스트루먼트 Inc	20X(S-형광) 및 40배(플랜 형광)
니콘 도립 현미경	니콘 인스트루먼트 Inc	이클립스 TS100
마이크로주사기 펌프 컨트롤러 (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), 미국 플로리다주 새러소타	SYS-마이크로4
방진 테이블	Technical Manufacturing, 미국 매사추세츠주 피바디	마이크로 g
증폭기	Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
헤드스테이지	분자 장치	HS-2A 및 HS-9A
함수 생성기	EZ Digital, 서울, 한국	FG-8002
데이터 수집 시스템	Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일	디지데이터 1550A
가청 베이스라인 모니터	Ampol US LLC, 미국 플로리다주 새러소타	BM-A-TM
디지털 스토리지 오실로스코프	Tektronix, Beaverton, Oregon, 미국	TDS 2024B
형광 시스템 인터페이스, ARC 램프 + 전원 공급 장치, 하이퍼 스위치, PMT	Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일	IonOptix 시스템
온도 조절기	워너 인스트루먼트	TC-344B 또는 C
인라인 히터	워너 인스트루먼트	쉬-27B
밸브 컨트롤러	워너 인스트루먼트	VC-6
인라인 유량 제어 밸브	워너 인스트루먼트	FR-50
전자 풀러	Sutter Instruments, 미국 캘리포니아주 노바토	P-97 또는 P-1000
마이크로포지	Narishige, East Meadow, NY, 미국	MF-900
붕규산 유리관(Trituration)	World Precision Instruments (WPI), 미국 플로리다주 새러소타	AN-번호 1B100-4
붕규산 유리관(고정)	워너 인스트루먼트	G150T-6
붕규산 유리관(날카로운 전극)	워너 인스트루먼트	GC100F-10
주사기 필터(0.22μm)	써모피셔 사이언티픽	Tel.: 722-2520
유리 페트리 접시 + 숯 실가드	Living Systems Instrumentation, 미국 버몬트주 세인트알반스시티	DD-90-S-BLK(블랙)
Vannas 스타일 가위 (3mm & 9.5mm)	세계적인 정밀 기기	555640초, 14364
가위 3 & 7mm 블레이드	Fine Science Tools(또는 FST), 포스터 시티, 캘리포니아, 미국	모리아 MC52 & 15000-00
날카롭고 끝이 가는 집게	증권 시세	뒤몽 #5 & 뒤몽 #55