전기생리학적 기록을 사용한 공동 배양에서의 신경 연결 형성 평가

초록

출처: Su, C. T. E., et al. 공동 배양 시스템에서 신경 세포 연결의 형성을 평가하기 위한 광유전학적 접근 방식. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오는 iPSC 유래 뉴런과 쥐 피질 뉴런 사이의 신경 연결을 평가하기 위한 전기생리학적 기록을 보여주고, 빛에 민감한 이온 채널을 활성화하고 시냅스후 전류를 감지하여 공동 배양에서 시냅스 접촉을 확인합니다.

프로토콜

1. iPSC 유래 뉴런의 전기생리학적 기록

1. 인간 iPSC가 성숙한 뉴런처럼 행동하는지 확인합니다.
   1. 60X(0.9 NA) 수침 렌즈가 장착된 정립 컨포칼 현미경을 사용하여 tdTomato를 시각화하여 인간 iPSC와 차별화된 세포를 찾을 수 있습니다.
   2. 기록 피펫을 4-6M의 저항으로 당깁니다.95% O₂/ 5% CO₂로 일정하게 기포된 외부 용액의 실온에서 관류 셀을 관류합니다. 기록 마이크로피펫에 내부 용액을 채웁니다.
   3. 전체 셀 모드에서 tdTomato+ 셀을 패치하고 전류 클램프에서 전류 주입(1초 지속, 10pA 증분)에 대한 반응으로 활동전위 발화를 기록합니다.
2. ChR2를 발현하는 피질 세포의 활동 전위가 광 자극에 의해 안정적으로 유발되는지 확인합니다.
   1. 컨포칼 현미경에서 GFP를 시각화하여 ChR2를 발현하는 피질 세포를 찾습니다. 1.1.2 - 1.1.3 단계에 따라 피질 세포에 대한 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행합니다.
   2. 수은 아크 램프(100W)를 사용한 조명 조명에 의해 활동 전위가 안정적으로 유발되는지 확인하십시오. 여기 필터의 파장은 480/40nm입니다.
3. 광유전학적 자극을 수행합니다.
   1. 전체 셀 모드에서 tdTomato+ 셀을 패치하고 볼륨을 설정합니다.tage clamp -70mV에서. 2kHz에서 전류 신호를 필터링하고 10kHz에서 디지털화합니다. 기록 중 일관성을 위해 10에서 20M 범위의 직렬 저항을 모니터링합니다.
   2. 100W 수은 램프와 480/40nm 여기 필터로 30초 동안 전체 필드를 자극합니다.
   3. ChR2 발현 시냅스전 피질 뉴런의 광자극에 의해 유도된 패치된 세포의 시냅스후 전류(PSC)를 기록합니다. PSC를 검출하고 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화나트륨	시그마	S7653
케이클	시그마	P5405
나HCO3	시그마	S5761
나H2PO4	플루카	71505
재질 보기 MgCl2	시그마	M8266
염화칼슘2	시그마	C1016
D(+)-포도당	시그마	G7520	전기생리학 연구용
K-글루코네이트	시그마	P1847
코	KANTO 화학	3234400
헤페스	시그마	H3375 (영문	전기생리학 연구용
에그타	시그마	E3889
Na2ATP	시그마	A7699
나3GTP	시그마	G8877
붕규산 유리 모세관	세계 정밀 기기, Inc	1604323
수은 쇼트 아크 램프	오스람	HBO 103 승/2

(영문) (영문) )