시냅스 공동 배양에서 배쪽 해마 축삭을 따라 니코틴 유도 칼슘 신호 전달 이미징

초록

출처: Zhong, C., et al., 복부 해마 축삭을 따라 니코틴 유도 칼슘 신호 전달 및 신경 전달 물질 방출의 라이브 이미징. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오는 마우스의 복부 해마에서 니코틴 성 아세틸콜린 수용체의 니코틴 매개 활성화가 축삭을 따라 지속적인 칼슘 신호를 어떻게 초래하는지 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 칼슘 이미징

1. 배양액을 일반 HBS로 빠르게 헹구고(시험관 내 5 - 7일) 37°C 및 5% CO₂에서 30분 동안 HBS(2ml)에서 5μM Fluo-4 Ca²⁺ 지시약(AM 에스테르) 및 0.02% Pluronic F-127로 배양물을 로드합니다.
2. HBS로 Fluo-4 용액을 세척합니다(3회/5분). 배양물을 최소 30분 동안 배양기(37°C / 5% CO₂)에 다시 넣습니다.
3. 이미징 챔버에서 배양물(5 - 7일 in vitro)을 유지하고 챔버를 회전 디스크 컨포칼 현미경에 장착합니다. RT에서 HBS 칵테일을 지속적으로 관류(1ml/분)합니다.
4. Plan-Apochromat 대물렌즈(1.4 NA, 여기 488 nm, 방출 530 nm의 60X 물) 및 CCD 카메라를 사용하여 vHipp 마이크로 슬라이스에서 축삭 돌기의 Fluo-4 형광 이미지를 수집합니다.
5. 프리니코틴 대조군으로 기준선 Fluo-4 형광 이미지(10초마다 2분 동안 2분)를 수집합니다. 1분 동안 빠른 관류(2ml/분)로 니코틴(1μM)을 바르고 HBS 칵테일로 니코틴을 씻습니다. 니코틴 적용 전, 도중, 후에 10초 간격으로 30분 동안 타임랩스 이미지를 계속 캡처합니다.
6. 원시 fluo-4 형광 이미지의 모든 프레임을 저장하고 추가 분석을 위해 일련의 TIFF 이미지로 내보냅니다.
7. 니코틴 적용 전후에 vHipp 축삭돌기를 따라 fluo-4 형광의 통합 강도를 수집합니다.
8. 다음 방정식을 사용하여 통합 형광 강도를 정규화합니다: ΔF/F₀ = (F-F₀)/F₀, 여기서 F₀는 배경 보정된 니코틴 전 통합 형광 강도이고, F는 니코틴 적용 후 각 시점에서 vHipp 축삭을 따라 통합된 형광 강도입니다. 정규화된 통합 형광 강도를 분석하고 플롯합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
라이브 이미징을 위한 HBS 칵테일 pH=7.3
염화나트륨	시그마	S9888	135 밀리미터미터
케이클	시그마	P9333	5 밀리미터미터
염화마그네슘	시그마	M8266	1 밀리엠
염화칼슘	시그마	C1016	2 밀리엠
헤페스	시그마	H3375 (영문	10 밀리미터미터
포도당	시그마	G0350500	10 밀리미터미터
테트로도톡신	토크리스	1078	2 μM
바이큘린	토크리스	131	10 μM
D-AP-5	토크리스	105	50 마이크로미터
씨엔큐엑스	토크리스	1045	20 μM
LY341495	토크리스	1209	10 μM

(영문) ) 년 의 의 년 년