시냅스 공동 배양에서 배쪽 해마 축삭을 따라 니코틴 유도 칼슘 신호 전달 이미징

초록

출처: Zhong, C., et al., 복부 해마 축삭을 따라 니코틴 유도 칼슘 신호 전달 및 신경 전달 물질 방출의 라이브 이미징. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오는 마우스의 복부 해마에서 니코틴 성 아세틸콜린 수용체의 니코틴 매개 활성화가 축삭을 따라 지속적인 칼슘 신호를 어떻게 초래하는지 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 칼슘 이미징

1. 배양액을 일반 HBS로 빠르게 헹구고(시험관 내 5 - 7일) 37°C 및 5% CO₂에서 30분 동안 HBS(2ml)에서 5μM Fluo-4 Ca²⁺ 지시약(AM 에스테르) 및 0.02% Pluronic F-127로 배양물을 로드합니다.
2. HBS로 Fluo-4 용액을 세척합니다(3회/5분). 배양물을 최소 30분 동안 배양기(37°C / 5% CO₂)에 다시 넣습니다.
3. 이미징 챔버에서 배양물(5 - 7일 in vitro)을 유지하고 챔버를 회전 디스크 컨포칼 현미경에 장착합니다. RT에서 HBS 칵테일을 지속적으로 관류(1ml/분)합니다.
4. Plan-Apochromat 대물렌즈(1.4 NA, 여기 488 nm, 방출 530 nm의 60X 물) 및 CCD 카메라를 사용하여 vHipp 마이크로 슬라이스에서 축삭 돌기의 Fluo-4 형광 이미지를 수집합니다.
5. 프리니코틴 대조군으로 기준선 Fluo-4 형광 이미지(10초마다 2분 동안 2분)를 수집....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
라이브 이미징을 위한 HBS 칵테일 pH=7.3
염화나트륨	시그마	S9888	135 밀리미터미터
케이클	시그마	P9333	5 밀리미터미터
염화마그네슘	시그마	M8266	1 밀리엠
염화칼슘	시그마	C1016	2 밀리엠
헤페스	시그마	H3375 (영문	10 밀리미터미터
포도당	시그마	G0350500	10 밀리미터미터
테트로도톡신	토크리스	1078	2 μM
바이큘린	토크리스	131	10 μM
D-AP-5	토크리스	105	50 마이크로미터
씨엔큐엑스	토크리스	1045	20 μM
LY341495	토크리스	1209	10 μM

(영문) ) 년 의 의 년 년