Testing Sensory Nerve Function in a Surgically Denervated Mouse 모델

초록

출처: Peterson, S. C. et al., 피부 외과적 탈신경: 피부 질환의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구 사항을 테스트하는 방법. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 수술로 한쪽을 제거하고 다른 쪽은 대조군으로 남겨두어 마우스 모델의 감각 신경 기능을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 기계적 자극에 대한 반응은 감각 신경의 역할을 확인시켜줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 외과적 탈신경

1. 마취액을 마우스 체중 20g당 200μl의 용량으로 복강내로 주입합니다. 발가락 꼬집음 분석을 통해 동물이 적절한 진정 수준에 도달했는지 확인하고 심장 박동수와 호흡수가 정상인지 확인합니다(각각 분당 약 600회 및 160회 호흡).
2. 베타딘과 알코올 물티슈를 사용하여 등 피부의 수술 부위를 준비하고 멸균 수술용 드레이프로 동물을 덮습니다(시연 목적으로 가시성을 높이기 위해 멸균 드레이프는 생략했습니다).무균 수술 부위에서 수술하는 동안 발열 패드를 사용하여 동물을 따뜻하게 유지하십시오.
3. 멸균 #11 메스를 사용하여 목 밑에서 꼬리 위 약 0.5cm까지 등 정중선을 따라 절개합니다.
4. 뭉툭한 집게를 사용하여 옆구리에서 멀리 떨어진 왼쪽의 피부를 부드럽게 반사하여 목 근처의 견갑골 지방 패드에서 뒷다리 바로 위까지 기본 조직을 시각화합니다.
   메모: 등쪽 피부 신경은 몸통 벽의 반투명 근막을 통해 꼬리 방향으로 이동한 후 급격히 구부러져 피부 아래의 느슨한 결합 조직으로 들어가는 흰색 가닥으로 나타납니다(그림 1).
5. 해부용 광학 현미경으로 초미세 집게를 사용하여 몸통 벽에서 구부러진 분절이 피부 입구 부위까지 뽑아서 해부학적 부위 T3-12에 위치한 동물의 왼쪽에서만 신경을 제거합니다(그림 1).
   1. 겸자를 수직으로 정하고 굴곡 부위 아래 약 0.5cm를 잡고 위로 당겨 신경을 제거하면 신경이 늘어나 주변 조직과 분리됩니다(그림 1C-E). 인접한 혈관이 파열되지 않도록 주의하십시오.
   2. 몸통 벽에서 피부까지 뻗어 있는 모든 신경이 제거될 때까지 계속하십시오. 몸통 벽의 빽빽한 근막 내의 신경을 방해하지 마십시오. 멸균 0.9% 식염수 한 방울을 주기적으로 떨어뜨려 시술 내내 조직을 촉촉하게 유지하십시오.
   3. 또는 집게로 몸통 벽 근처의 근위 끝을 잡고 가는 가위로 잘라서 신경을 제거합니다. 그런 다음 피부 근처의 말단부를 절단합니다(그림 1F-H). 마지막으로, 중간에 있는 신경 분절을 제거합니다(그림 1I).
6. 1.4단계에서 노출된 피부 피판의 신경을 제거합니다. 이 섬유는 등쪽 피부 신경의 원위 가지를 구성하며 피부 피판의 진피 쪽에 있는 결합 조직 내에 산발적으로 위치한 흰색 분기 가닥으로 나타납니다(그림 1J-K).
   1. 이 미세한 가지를 제거하려면 미세한 집게를 피부 표면과 대략 평행하게 놓고 신경을 잡고 위쪽으로 뽑아 혈관이 파괴되고 피부에 구멍이 뚫리지 않도록 합니다. 눈에 보이는 모든 신경이 제거될 때까지 계속하십시오.
7. 둔기 절개를 사용하여 등쪽 정중선 절개 부위의 오른쪽 피부를 반사하되 신경을 제거하지 않습니다. 이것은 반대쪽 가짜 작동 제어 역할을 합니다.
8. 6-0 나일론 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합하기 위해 약 3mm 간격으로 간단한 단속 패턴으로 등쪽 정중선을 따라 봉합합니다.
9. 완전히 회복될 때까지 수술을 받은 쥐를 다른 동물과 같은 우리에 다시 넣지 마십시오.
10. 수술 직후 동물이 의식을 회복할 때까지 모니터링하고, 일반적으로 1주일 이내에 수술 부위가 치유될 때까지 매일 모니터링합니다. 지정된 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 진통제를 사용하고 생쥐가 통증이나 괴로움의 징후를 보일 경우 사용하십시오. 수술 후 7-10일 이내에 봉합사를 제거하십시오. 메모: 필요한 경우 카프로펜(50mg/ml 원액)을 멸균수에 1:100으로 희석하여 진통제를 준비합니다. 목덜미 근처의 견갑골 사이에 체중 20g당 200μl(마우스 체중 5mg/kg)의 용량으로 용액을 피하주사합니다.
11. 수술 후 최대 몇 주까지 안정적인 탈신경을 기능적으로 평가하려면 전기 클리퍼를 사용하여 등쪽 피부의 털을 제거합니다.
12. 피하 주사 바늘을 사용하여 탈신경화된 피부 부위를 부드럽게 찌르고 동물이 일반적으로 몸을 떨거나 고개를 돌리는 등의 반응을 보이는지 확인합니다. 피부 부위가 안정적으로 탈신경된 경우, 동물은 거의 또는 전혀 반응을 보이지 않을 것입니다.

결과

그림 1. 등쪽 피부를 탈신경화하는 두 가지 방법. (A) 신경이 분포된 쥐 피부의 만화 다이어그램. 빨간색 점선은 등쪽 정중선을 따라 한 번 절제하여 몸통 벽의 기저 근육 조직(보라색)과 반사된 피부 아래의 진피(회색, 별표)를 노출시키는 것을 나타냅니다. 꼬리 방향으로 이동하는 등쪽 피부 신경은 몸통 벽을 떠날 때 "구부러진" 것처럼 보입니다(검은색 화살표는 그러한 구부러진 것 중 하나를 나타냄). 절제할 신경 분절은 검은색 점선으로 구분됩니다. (B) 구부러진 부위가 표시된 손상되지 않은 신경의 사진(화살표). 파란색 화살표는 제거될 2개의 신경 분절을 가리킵니다. (C-D) 탈신경 기술을 보여주는 사진. 초미세 집게를 사용하여 구부린 부위 아래 0.5cm 신경을 잡고 바깥쪽으로 당깁니다. (E) 2개의 신경...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알코올 준비 패드	PDI	나339
아나세드(자일라진)	로이드	나다 139-236
베타딘 프렙 패드	메드라인	MDS093917
카르프로펜(리마딜)	조에티스
무선 충전식 클리퍼	왈	트리머 모델 8900
6-0 나일론 봉합사	(주)디메텍	NL166012F4P
초미세집게	뒤몽	0103-5-포