초파리 광수용체(Drosophila Photoreceptor)에서 PDA(Prolonged Depolarizing Afterpotential) 조사

초록

출처: Gutorov, R., et al. 초파리 광수용체의 광색소 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 흰눈초파리에서 장기간의 탈분극 후전위(PDA)를 조사하기 위한 실험 프로토콜을 보여줍니다. 파리의 눈은 강렬한 청색광 펄스에 노출되어 광색소 로돕신을 메타로돕신으로 변환하여 양이온 채널을 열고 막 탈분극을 유발하는 신호 폭포를 시작합니다. 청색광은 메타로돕신이 로돕신으로 재전환되는 것을 막기 때문에 양이온의 지속적인 유입은 장기간의 탈분극 후전위(PDA)로 알려진 지속적인 탈분극을 초래합니다.

프로토콜

1. 망막전위도를 이용한 PDA(Prolonged Depolarizing Afterpotential) 측정

1. Drosophila melanogaster 준비를 위한 적당한 사육 조건
   1. Raise D. melanogaster는 24 ° C의 온도와 12 시간의 어둡고 밝은 주기로 유지되는 인큐베이터에서 음식이 들어있는 표준 노란색 옥수수가 들어있는 병에서 비행합니다.
   2. 실험 최소 24시간 전에 파리 병을 어두운 곳에 보관하십시오.
2. 일반 설정
   1. 1mm x 0.58mm(O.D x I.D) 섬유로 채워진 붕규산 유리 모세관을 당겨 기록 피펫을 준비합니다(그림 1L, O). 피펫의 저항은 5-10 MΩ이어야합니다. 적절한 풀러를 사용할 수 있습니다.
   2. 두 개의 은선을 AgCl₂로 코팅하고 0.25mm 은선을 맞춤형 5V 전원 공급 장치에 연결된 3M KCl 용액에 삽입합니다.
   3. 코팅된 각 은선을 전극 홀더에 삽입합니다(그림 1N).
   4. 길쭉한 팁 주사기(그림 1M)를 사용하여 여과된 Ringer 용액(표 1 참조)으로 유리 모세관을 채웁니다.
   5. 와이어 전극을 유리 모세관에 삽입합니다. 모세관 내의 용액이 은선과 접촉하고 있는지 확인하십시오.
   6. 전극 홀더(그림 2P, N)를 두 개의 전극 미세 조작기(그림 2G)에 삽입합니다.
3. 전기 녹음을 위한 플라이 준비 절차
   알림: 어둡게 적응된 조건에서 파리를 유지하려면 다음 단계에서 희미한 적색 조명 만 사용하십시오.
   1. 플라이 슬리퍼 시스템(그림 1A, B)을 사용하여 병에 든 파리를 CO₂ 가스로 마취하고 슬리퍼 용기에 붓습니다.
   2. 파리 한 마리를 선택하고 날카로운 핀셋을 사용하여 날개를 조심스럽게 잡습니다. 나머지 파리를 페트리 접시로 덮습니다.
   3. 플라이 홀더에 플라이를 등을 손쪽으로 향하게 하여 옆으로 눕히는 올바른 방향으로 놓습니다(그림 1P).
   4. 납땜 인두의 전원 공급 장치를 켭니다. 전류를 ~2.25A로 설정합니다. 이 전류는 0.25mm 백금-이리듐 필라멘트를 ~55-56°C로 가열해야 합니다.
   5. 납땜 인두에 낮은 용융 온도(~55-56 °C)의 왁스 한 방울을 놓습니다(그림 1F).
   6. 핀셋을 사용하여 날개에서 파리를 들어 올리고 납땜 인두를 사용하여 날개를 플라이 홀더(그림 1I)에 고정합니다.
   7. 납땜 인두를 사용하여 왁스로 파리의 등을 스탠드 표면에 연결합니다(그림 1P).
   8. 납땜 인두의 끝을 다리의 접합 지점으로 내리고 왁스를 녹여 모든 다리를 함께 덮습니다(그림 1P).
   9. 목 부분의 머리와 등 사이에 작은 왁스 한 방울을 떨어뜨립니다(그림 1P).
      알림: 플라이 헤드가 과열되지 않도록 특히 주의하십시오. 파리가 제대로 고정되어 있고 실험 중에 움직일 수 없는지 확인하십시오. 사소한 움직임은 녹음에 아티팩트를 생성할 수 있습니다. 흉부와 복부의 기관 구멍(호흡구)이 왁스로 덮여 있지 않은지 확인하십시오.
   10. 플라이 홀더(그림 2Q)를 자석 블록(그림 2I)의 어두운 패러데이 케이지에 놓고 플라이가 라이트 가이드(그림 2L) 끝에서 ~5mm 떨어져 있는지 확인합니다.
   11. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 기록 전극(그림 2P)을 파리의 눈 위에 놓고 접지 전극(그림 2N)을 파리의 등 위쪽 위에 놓습니다.
   12. 미세 조작기를 사용하여 접지 전극을 플라이 뒷면에 삽입합니다.
   13. 기록 전극을 파리의 눈 바깥쪽 주변에 삽입하는 것이 좋으며, 가급적이면 micromanipulators를 사용합니다.
       메모: 전극을 눈에 삽입한 후 작은 보조개가 관찰됩니다. 보조개가 사라질 때까지 눈에서 전극을 제거하지 않고 전극을 위로 당깁니다. 전극은 또한 몸통과 눈에 적용된 전극 젤리의 작은 방울에 담글 수 있습니다.
4. PDA 프로토콜(이 프로토콜은 흰눈파리에서만 수행할 수 있음)
   1. 주황색 필터(최대 광색소를 R 상태로 변환하기 위해 590 가장자리 필터)를 사용하여 최대 강도의 광 펄스를 5초 동안 제공합니다.
   2. 주황색 필터를 광대역 청색(BP450/40nm) 필터로 교체하고 최대 강도로 5초 광 펄스를 세 번 제공합니다.
      알림: 정상 상태 전압 응답에 도달할 때까지 길고 연속적인 최대 강도의 청색광 펄스를 제공하는 것도 가능합니다.
   3. 어둠 속에서 60초 동안 기다렸다가 파란색 필터를 이전 주황색 필터로 교체하고 5초 간격으로 두 번의 60초 광 펄스를 제공합니다.

표 1: Ringer 솔루션의 구성

의 개 개 개 분

Ringer의 솔루션
시약	농도 (mM)
염화나트륨	130
케이클	2
재질 보기 MgCl2	5
염화칼슘2	2
헤페스	10
NaOH 및 HCl을 사용하여 7.15까지 pH 적정

결과

그림 1: 플라이 고정 및 피펫 준비 기록에 필요한 도구 및 장치. (A) 플라이 슬리퍼 시스템; (B) 플라이 슬리퍼 시스템 페달; (C) 차가운 광원; (D) 실체 현미경; (E) 왁스 필라멘트 히터; (F) 납땜 인두; (G) 왁스 필라멘트 히터 페달; (H) 거친 핀셋; (I) 마그네틱 플라이 스탠드; (J) 낮은 용융 온도 왁스; (K) 섬세한 물티슈; (L) 수직 피펫 풀러; (M) 끝이 길쭉한 주사기; (N) 전극 홀더; (O) 붕규산 유리 모세관; (P) 고정 플라이.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
팁이 길쭉한 1mL 주사기			그림 1M
러프 핀셋 1		Dumont #5, 스탠다드	0.1mm x 0.06mm, 길이 110mm, Inox(그림 1H)
2개의 콘덴서 렌즈
A/D 컨버터	분자 장치	디지데이터 1200	가능한 교체: 분자 장치(예: 1440A)의 모든 digidata - 그림 2C
증폭기	거의 완벽한 전자 장치		가능한 교체 : Warner instruments- IE251A 또는 IE-210 (헤드 스테이지와 함께 제공) - 그림 2D
방진 테이블	뉴포트	폭스바겐-3036-옵트-01	그림 7H
모 세관	하버드 기구	붕규산 유리 모세관	1mm x 0.58mm(그림 1O)
클램프펙스	분자 장치		소프트웨어
CO2 탱크
차가운 광원	쇼트	KL1500 액정	그림 1C
섬세한 와이퍼	(주)킴텍		Kimwipes(그림 1K)
전극 홀더			모세관 O.D. 1mm에 적합(그림 1N, 그림 2N 및 그림 2P)
패러데이 케이지	집에서 만든		전자기 노이즈 차폐 및 흑색 전면 커튼(그림 2K)
필터(색상)	쇼트	OG590, 엣지 필터	그림 2S
필터(색상)	쇼트	BP450/40 nm의	그림 2S
필터(색상)	블 레이저 코트	550 nm의	그림 2S
차가운 광원을 위한 여과기 (색깔)	쇼트	RG630	그림 1C
필터 (열)	쇼트	KG3	그림 1S
필터(중성 밀도 필터)	크로마	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	그림 2S
플래시 램프 시스템	니 웰		그림 2U
인젝터가 있는 플라이 슬리퍼 시스템	주입 + matic		그림 1A-B
램프 전원 공급 장치	증권 시세	LPS-220	그림 2W
광 감지기	집에서 만든		광 트랜지스터(그림 2O)
라이트 가이드			직경 3mm, 길이 1.3m(그림 2L, M)
광원			고압 오존이 없는 75W 크세논 램프(50W에서 작동), 교체 가능: Cairn research- OptoLED(그림 7R)
저온 용융 왁스	집에서 만든		밀랍(Tm≈62 °C)과 파라핀의 혼합물로 ~3:1로 구성되어 ~55– 56 °C의 용융 온도에 도달합니다(그림 6J).
파리용 마그네틱 스탠드	집에서 만든		그림 1I 및 그림 2Q
헤드 스테이지가 있는 미세 전극 프리amp 시스템	거의 완벽한 전자 장치		임피던스 테스터(그림 2G)
Micromanipulator (기계적, 거친)	트라이텍 리서치, 나리시게	남-2
Micromanipulator (기계적 미세)	라이츠 마이크로시스템즈	Leitz 기계식 마이크로매니퓰레이터	그림 2F
p클램프	분자 장치		소프트웨어
페트리 접시			60의 mm
펄스 발생기	AMPI (영어	마스터 8	그림 2A
심전도를 위한 Redux 크림	파커 연구소	Redux 전해질 크림
셔터 드라이버	유니블리츠, 빈센트 어소시에이츠	VCM-D1 단일 채널 단일 안정	그림 2V
셔터 시스템	유니블리츠, 빈센트 어소시에이츠	LS2 2mm 유니 안정 셔터	그림 2V
실버 와이어	워너 인스트루먼트		직경 0.25–1mm, 염소화 필요
백금-이리듐 필라멘트로 구성된 납땜 인두			직경 0.25mm(그림 2F)
입체 줌 현미경	니콘	SMZ-2B	그림 1D
입체 줌 현미경	야생의	와일드 M5	6, 12, 25 및 50 배율 설정(그림 2E)
주사기 필터	밀렉스		22μm PVDF 필터
수직 피펫 풀러	셔터/나리시게	모델 P-97/PP-830	원하는 대로 수직 또는 수평 풀러를 사용하십시오(그림 1L).
왁스 필라멘트 히터	집에서 만든		그림 1E-G
제논 플래시 램프 시스템	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	그림 2X

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