Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice(편도체 뇌 절편에서 신경 경로의 시각화 및 매핑)

Abstract

출처: Bosch, D., et al. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 생쥐의 급성 편도체 뇌 절편을 사용하여 내측 전전두엽 피질(mPFC)과 편도체 뉴런 사이의 시냅스 연결성을 분석하는 절차를 보여줍니다. 이 마우스의 mPFC 뉴런은 형광 단백질에 융합된 채널로돕신을 발현합니다. 채널로돕신은 광 활성화 시 mPFC 뉴런에서 이온 유입 및 활동 전위 생성을 촉진합니다. 결과적으로, mPFC 뉴런은 시냅스후 편도체 뉴런에 결합하는 신경전달물질을 방출하여 mPFC-편도체 연결성을 시각화하기 위해 기록된 시냅스후 전류를 트리거합니다.

Protocol

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 시냅스전 섬유의 시각화 및 자극

1. 섬유와 세포의 광유전학적 활성화를 위한 패치 현미경 준비:
   1. 장착된 발광 다이오드(LED)를 광 전달 경로의 중앙에 놓습니다.
   2. 470nm의 적절한 파장을 선택하는 파워 미터를 사용하여 후면 초점면과 각 대물렌즈의 출력에서 LED 광도를 측정합니다.
   3. 광도를 mW/^mm2 단위로 계산하고 470nm 파장에 대해 측정된 값에 대해 각 대물렌즈에 대한 보정 곡선(LED 강도(%) 대 광 출력(mW/mm²))을 생성합니다.
2. 계면 챔버에서 급성 편도체 절편을 추출하여 형광등이 장착된 정립 현미경에 장착된 절편 챔버에 넣습니다. 인터페이스 챔버에서 위쪽을 향하는 슬라이스 표면이 기록 챔버에서도 위쪽을 향하도록 슬라이스를 배치하도록 주의하십시오. ~31 °C의 온도에서 1 - 2 ml/min의 속도로 신선한 산소가 공급된 인공 뇌척수액(ACSF)을 슬라이스를 관류합니다.
3. 발현된 특정 형광 단백질에 대한 적절한 필터 세트와 함께 형광등을 사용하여 슬라이스의 시냅스전 섬유를 관찰합니다. 5x 대물렌즈를 사용하여 개요를 얻고(그림 1E) 60x 대물렌즈를 사용하여 대상 영역 내의 섬유 밀도를 평가합니다.
   참고: GFP 및 YFP의 경우, 재료/장비 표에 명시된 대로 mCherry 사용 필터 세트 "빨간색"(Excitation 560/40, Beamsplitter 585, Emission 630/70)에 필터 세트 "녹색"(Excitation 472/20, Beamsplitter 495, Emission 490 LP)을 사용합니다.
4. 실험에 필요한 대로 현미경 광 경로의 조리개를 열거나 제한합니다(그림 2D).
5. 패치 기록을 얻으려면 패치 피펫에 내부 용액을 채우고 전극 홀더에 장착합니다. 패치 피펫에 양압을 가하고 먼저 수조 용액에 천천히 내린 다음 미세 조작기를 사용하여 육안으로 제어하여 슬라이스로 내립니다.
   1. 옆면과 위쪽에서 패치 피펫으로 관심 뉴런에 접근합니다. 피펫이 셀 표면에 있을 때 양압을 해제하고(세포 표면에서 보이는 보조개) 음압을 적용하여 "기가씰"을 얻습니다.
   2. 전체 세포 기록을 얻기 위해 멤브레인 패치를 파열시키기 위해 추가 흡입을 가합니다. 그런 다음 세포의 전기 반응을 기록하면서 채널로돕신(ChR)(470nm)을 활성화하기 위한 적절한 파장을 사용하여 연결된 LED로 라벨링된 광섬유를 자극합니다.
   3. 시냅스 자극의 경우 낮은 LED 강도로 시작하여 원하는 시냅스 전류 진폭에 도달할 때까지 증가시킵니다. 타이밍 및 펄스 길이를 제어하기 위해 데이터 수집 소프트웨어에서 디지털 출력을 구성하여 LED를 트리거합니다(그림 3의 예).
      참고: 다른 소프트웨어 및/또는 TTL 생성 장치를 사용하여 LED를 트리거할 수 있습니다.
6. 다음에 기록된 세포 및/또는 특정 약물의 존재 하에 원하는 대로 현미경 광 경로에서 조리개를 열거나 제한한 상태에서 자극을 반복합니다(단계 1.4).

Results

그림 1. 정위 주사, 급성 뇌 절편 준비 및 시냅스 전 섬유의 시각화. (가, 나) 정위 바이러스 주입. A) 두개골이 노출된 정위 프레임에 배치된 마취된 마우스와 주입 피펫의 사진. 삽입 사진: 빠른 녹색과 혼합된 바이러스 용액으로 채워진 주입 피펫의 사진을 확대합니다. 스케일 바: 3mm. (B) 다양한 주입 영역에 대한 드릴 구멍의 위치가 표시된 마우스 두개골의 개략도. (C) 이 연구에 사용된 다양한 바이러스 구조를 보여주는 계획. 짙은 회색: 프로모터 서열; 청색: 채널로돕신2 (ChR2 (H134R)); 녹색/빨간색: 형광 단백질. 발현 시간은 국소 편도체 투영의 경우 2주, mPFC 및 MGm/PIN의 투영의 경우 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
인공 뇌척수액(ACSF)	구성에 대해서는 참고 문헌 #16 및 #23을 참조하십시오
내부 패치 솔루션	구성에 대해서는 참고 문헌 #16 및 #23을 참조하십시오
마그네슘황산염 헵타하이드레이트	Roth, 독일	P027.1	정제수에 2M 원액을 준비합니다.
입체경, SZX2-RFA16	올림푸스, 일본
Xcite 형광등(XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, 캐나다	2012-12699
패치 현미경, BX51WI	올림푸스, 일본
멀티클램프 700B 패치 앰프	Molecular Devices, 미국
디지트데이터 1440A	Molecular Devices, 미국
PClamp 소프트웨어, 버전 10	Molecular Devices, 미국		데이터 수집 및 시뮬레이션을 제어하는 데 사용됩니다.
수조 온도 조절기, TC05	Luigs & Neumann, 독일	200-100 500 0145
3축 마이크로 매니퓰레이터 미니 25	Luigs & Neumann, 독일	210-100 000 0010
마이크로매니퓰레이터 컨트롤러 SM7	Luigs & Neumann, 독일	전화: 200-100 900 7311
패치 피펫을 위한 유리 모세관	World Precision Instruments, 독일	GB150F-8P
인터페이스 챔버용 셀룰로오스 질산염 여과지	Satorius Stedim Biotech, 독일	13006--50----ACN
LED 장치, CoolLED pE	CoolLED, 영국	244-1400	CoolLED 또는 USL 70/470 및 적절한 어댑터는 LED 시뮬레이션을 위한 두 가지 대안입니다.
CoolLED 100 듀얼 어댑트	CoolLED, 영국	pE-어댑터-50E
LED 장치, USL 70/470	Rapp 광전자 장치	L70-000
듀얼 포트 어댑터	Rapp 광전자 장치	회사에 문의
필터 세트 빨간색(여기)	AHF, 독일	F49-560	필터는 F46-008 세트로 구입할 수 있습니다
(빔스플리터)	AHF, 독일	F48-585
(배출)	AHF, 독일	F47-630
필터 세트 녹색(여기)	AHF, 독일	F39-472	대안: 필터 세트 F36-149 또는 F46-002(대역통과 방출 포함)
(빔스플리터)	AHF, 독일	F43-495W
(배출)	AHF, 독일	F76-490
LaserCheck, 휴대용 파워 미터	Coherent, 미국	1098293
IgorPro 소프트웨어, 버전 6	Wavemetrics, 미국		전기생리학 데이터 분석을 위해 다른 대체 소프트웨어 패키지도 사용할 수 있습니다.
IgorPro를 위한 Neuromatic 매크로 제품군	http://www.neuromatic.thinkrandom.com