쥐의 망막전도 및 시각 유발 잠재력 기록

초록

출처: Charng, J. et al. 의식 있는 쥐에서 무선 망막도 및 시각 유발 전위의 이식 및 기록. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 의식이 있는 쥐의 망막전도(ERG)와 시각 유발 전위(VEP)를 기록하는 방법을 보여줍니다. 외과적으로 전극을 이식한 쥐는 먼저 어둠에 적응한다. 확장 점안액을 적용한 후, 동물을 구속기에 넣고 Ganzfeld 그릇에 넣습니다. 그런 다음 ERG 및 VEP 신호가 기록됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 전극 준비

참고: 외과적 임플란트에는 3채널 송신기가 사용되며, 이를 통해 2개의 망막 전위(ERG) 및 1개의 VEP(visual evoked potential) 기록을 동시에 수행할 수 있습니다. 3개의 활성 전극과 3개의 비활성 전극은 눈에 부착하기 위해 이식 전에 고리 모양으로 미리 성형해야 합니다. 식별을 위해 제조업체는 활성 전극을 반백색, 반색 플라스틱 덮개로 동봉하고 비활성 전극은 전체 색상 덮개로 덮습니다. 접지 전극(투명 플라스틱 피복)은 모든 활성 및 비활성 전극이 1.1, 1.2, 1.3 및 1.7 단계를 수행할 수 있도록 변경되지 않은 상태로 유지됩니다.

1. 끝이 가는 두 개의 플라이어로 이중 가닥 스테인리스강 전극을 풀어냅니다.
2. 스테인리스 스틸 가닥 중 하나(끝에서 약 1cm)를 자르고 링 전극을 형성하기 위해 하나의 더 긴 직선 가닥을 남깁니다.
3. 단일 스테인리스강 가닥을 다시 접고 비틀어 전극 끝에 부드러운 고리를 형성합니다.
4. ERG 활성 전극의 경우 루프의 바닥을 비틀어 이 루프 ~ 0.2 - 0.5 mm 직경을 형성하고(여기에 설명된 목적을 위해 두 눈의 ERG를 기록하기 위해 이러한 방식으로 두 개의 활성 전극을 형성합니다), ERG 비활성 및 VEP 전극의 경우 루프 직경 ~ 0.8 mm 직경을 만듭니다(이 예에서, 하나의 활성 VEP 전극과 3개의 비활성 전극 모두에 대해 이 작업을 수행합니다).
5. 원형 VEP 활성 전극을 스테인리스강 나사(직경 0.7mm, 길이 3mm)에 걸어 전극이 나사 머리에 닿도록 합니다.
6. 3개의 비활성 전극(2 ERG, 1 VEP)을 두 번째 스테인리스 스틸 나사(직경 0.7mm, 길이 3mm)에 겁니다.
7. 자극을 줄이기 위해 두 개의 스테인리스 스틸 가닥의 날카로운 끝 부분 위로 플라스틱 슬리브를 앞으로 당깁니다.
8. 텔레메트리 송신기를 약 2°C에서 10시간 이상 2% 글루타르알데히드에 담가 멸균합니다. 그런 다음 멸균 식염수로 트랜스미터를 세 번 헹굽니다.

2. 송신기 주입

1. 동물 준비
   1. 실험 전에 수술 부위를 70% 에탄올로 세척하여 소독합니다. 모든 수술 장비는 사용하기 전에 고압멸균하고 수술 중 사용하지 않을 때는 클로르헥시딘으로 장비를 유지하십시오. 무균 환경을 유지하기 위해 수술 중 동물을 수술용 드레이프로 덮으십시오. 모든 실험자가 수술용 마스크, 멸균 장갑 및 가운을 착용하도록 합니다.
   2. 3 L/min의 유속에서 1.5 - 2% 이소플루란으로 마취를 유도하고 수술 내내 2 L/min에서 1.5 - 2 %를 유지합니다. 발가락 사이의 근육을 꼬집을 때 페달 반사가 없어 충분한 마취 깊이를 확인하십시오.
   3. 사타구니 위에서 흉골까지 복부 위로 40mm x 30mm 영역을 면도합니다.
   4. 이마, 눈 뒤쪽, 귀 앞쪽을 30mm x 20mm 넓게 면도합니다.
   5. 면도한 두 부위를 소독합니다. 이마 부위는 10% 포비돈 요오드로 3회 소독합니다(외과 기술자 협회(Association of Surgical Technologists)에서 정한 실행 기준에 따라 눈 주변 부위에 알코올 기반 소독제 사용을 피하십시오). 복부에는 포비돈 요오드 10%와 에탄올 70%로 소독합니다.
   6. 추가적인 국소 마취를 위해 각막에 프록시메타카인 1방울을 바르십시오.
   7. 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 1방울을 각막에 바르면 눈의 건조를 방지할 수 있습니다.
2. 외과적 임플란트
   1. 외과용 메스로 귀 사이의 수직 정중선을 따라 머리를 10mm 절개합니다.
   2. 흉골 아래의 정중선을 따라 피부층을 통해 복부를 5mm 절개합니다.
   3. 5mm 직경의 캐뉼라를 복부 절개 부위에서 머리 절개 부위까지 피하
   터널을 뚫습니다.
   4. 송신기의 전극선(3개는 활성 및 3개는 비활성)을 캐뉼라를 통해 복부에서 머리까지 공급합니다.
   5. 기준 전극을 송신기 베이스와 함께 두고 전극 팁을 무균 거즈로 덮습니다.
   6. 전극 팁(3개 활성 및 3개 비활성 상태)을 무균 거즈로 덮습니다.
   7. 쥐의 머리를 입체 플랫폼에 고정합니다.
   8. 수술용 가위로 절개 부위를 30mm까지 연장합니다.
   9. ~ 3시와 9시 방향에 2 개의 봉합사 (3-0)로 늘어진 피부를 수축시켜 수술 부위를 노출시킵니다.
   10. 멸균된 거즈를 사용하여 두개골 위에 있는 골막을 긁어내어 브레그마, 람다, 정중선 봉합사를 노출시킵니다.
   11. VEP 활성(7mm 복부에서 브레그마까지, 3mm 측면에서 정중선까지) 및 비활성(5mm 복부에서 정중선의 브레그마까지) 입체 좌표에서 두개골을 통해 두 개의 구멍을 뚫습니다.
   12. 미리 부착된 스테인리스 스틸 나사(직경 0.7mm, 길이 3mm)가 있는 VEP 활성 및 비활성 전극을 작은 드라이버로 미리 만들어진 구멍에 ~ 1mm 깊이로 두개골에 부착합니다. 이것은 아래에 있는 피질 조직을 손상시키지 않고 나사를 뼈에 고정합니다.
   13. ERG 활성 전극을 이식하려면 8-0 봉합사를 사용하여 위 눈꺼풀을 일시적으로 후퇴시킵니다.
   14. 16-21G의 캐뉼라를 눈 뒤에서 상결막(superior conjunctival fornix)까지 피하로 삽입합니다.
   15. 안내 바늘을 제거합니다.
   16. 짧아진 플라스틱 카테터를 통해 이마에서 눈 쪽으로 활성 전극을 공급합니다. 그런 다음 플라스틱 카테터를 제거합니다.
   17. 전극 루프를 통해 나사산이 있는 임시 봉합사(8 - 0)를 사용하여 전극이 터널로 다시 후퇴하는 것을 방지합니다.
   18. 윤부 뒤쪽 12시 방향의 상결막을 0.5mm 절개합니다. 둔기 해부를 사용하여 아래에 있는 공막을 노출시킵니다.
   19. 8 - 0 또는 9 - 0 봉합사를 공막 두께의 절반으로 변연 바로 뒤에 이식합니다.
   20. ERG 활성 전극에서 임시 봉합사를 제거합니다.
   21. 3개의 연속된 매듭을 묶어 ERG 활성 전극을 절반 공막 두께 봉합사에 고정하고 전극 팁이 가장자리에 가깝게 위치하도록 합니다.
   22. 1-2회의 단속 봉합사(8 - 0 - 9 - 0)를 사용하여 결막 피판을 닫습니다. 결막이 ERG 전극을 완전히 덮도록 하여 편안함을 개선하십시오.
   23. 눈꺼풀 수축 봉합사를 제거합니다.
   24. 반대쪽 눈에 대해 절차를 반복합니다.
   25. 두개골에 시아노아크릴레이트 젤을 바르고 모든 스테인리스 나사와 전극선을 고정합니다. 안구 운동을 가능하게 하기 위해 고정하기 전에 ERG 활성 전극을 너무 세게 당기지 않았는지 확인하십시오.
   26. 흡수되지 않는 3-0 봉합사를 사용하여 머리의 상처를 봉합합니다.
   27. 설치류를 회전시켜 복부 부위를 노출시킵니다. 수술용 가위로 Linea alba를 따라 복부 절개 부위를 40mm까지 늘립니다.
   28. 내복강이 드러나도록 내근벽을 35mm 절개합니다.
   29. 두 개의 봉합사(3 - 0)를 사용하여 송신기 본체를 동물의 오른쪽 내복벽에 부착합니다. 간과의 접촉을 피하십시오.
   30. 접지 전극을 고리로 만들고 봉합사(3 - 0)로 이 모양으로 고정합니다. 그런 다음 복강에 자유롭게 떠다니는 곳에 놓습니다.
   31. 연속 봉합사(3 - 0)를 사용하여 복막을 닫습니다.
   32. 단속 봉합사(3 - 0)를 사용하여 절개 부위를 닫습니다.
3. 수술 후 관리
   1. 동물이 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 모니터링합니다. 수술 후 동물을 단독으로 수용하십시오.
   2. 진통제를 위해 카프로펜(5mg/kg)을 4일 동안 1일 1회 피하투여합니다.
   3. 수술 후 7일 동안 식수에 예방적 경구용 항생제(엔로플록신, 5mg/kg)를 첨가합니다.
   4. 피부 절개 부위에 항염증 연고를 바르면 수술 후 첫 7일 동안 자극을 줄일 수 있습니다.

3. 의식이 있는 쥐에서 ERG 및 VEP 녹음 수행

1. ERG 및 VEP 녹음 전 12시간 동안 동물을 어둡게 적응시킵니다.
2. 희미한 적색 조명(17.4cd.m-2, λmax = 600nm)에서 모든 실험 조작 수행
3. 각막에 국소 마취제(0.5% 프록시메타카인)와 확장제(트로피카미드 0.5%) 점안액을 투여합니다.
4. 의식이 있는 설치류를 맞춤형 투명 재조정기로 안내합니다.
   메모: 이 플라스틱 튜브의 길이는 전체 직경이 60mm로 고정된 상태에서 다양한 크기의 쥐를 수용할 수 있도록 조정할 수 있습니다. 장치의 앞쪽 끝은 머리의 움직임을 최소화하기 위해 가늘어지며 정상적인 호흡을 가능하게 하는 천공이 있습니다. 이 가늘어진 앞면은 쥐의 머리와 눈을 Ganzfeld 구의 개구부에 정렬하고 안정화할 수 있도록 합니다. 설치류는 수술 전에 구속기에 순응했습니다(3-5회).
5. 눈이 그릇의 입구와 정렬되도록 Ganzfeld 그릇 앞에 설치류를 놓습니다.
6. 내주 송신기의 ~ 5cm 이내에 자석을 통과시켜 켭니다. 그런 다음 수신기 베이스의 LED 상태 표시등을 확인하여 송신기가 켜져 있는지 확인합니다.
7. 다양한 발광 에너지(즉, -5.6 - 1.52 log cd.s.m²)에 걸쳐 신호를 수집합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
생체 증폭기	광고	ML 135 (ML	ERG 및 VEP 신호 증폭
카르복시메틸셀룰로오스나트륨 1.0%	엘러간	CAS 0009000-11-7	수술 중 각막 수분 유지
카프로펜 0.5%	화이자 동물 건강 그룹	CAS 53716-49-7	수액 보충을 위해 주사 가능한 식염수를 투여하는 수술 후 진통제
클로르헥사딘 0.5%	오리온 연구소	27411, 80085	수술 기구의 소독
시아노아크릴레이트 겔 활성제	RS 구성 요소	473-439	시아노아크릴레이트 겔을 빠르게 건조시킵니다.
시아노크릴레이트 겔	RS 구성 요소	473-423	스테인리스 나사를 두개골에 고정
치과 버	Storz Instruments, 바우쉬 & 롬	E0824A	VEP 나사를 이식하기 위해 각 반구의 두개골에 작은 구멍을 만들기 위한 ~0.7mm 직경의 소형 드릴 헤드
훈련	보쉬	Dremel 300 시리즈	트레패닝을 위한 자동 드릴
엔로플록신	트로이 연구소		수술 후 예방적 항생제
Ganzfeld 적분구	Photometric Solutions International (포토메트릭 솔루션)		맞춤형으로 설계된 광 자극기: 직경 36mm, 조리개 크기 13cm
거즈 면봉	Multigate 의료 제품 Pty Ltd	57-100B	수술 중 절개 부위와 노출된 두개골 표면을 건조시킵니다
이소플루란 99.9%	애보트 오스트랄라시아 Pty Ltd	CAS 26675-46-7	소유명: Isoflo(TM) 흡입 마취제. VEP 전극 임플란트 수술을 위한 산소 가스와 혼합된 제약 등급 흡입 마취제
케나콤 연고	아스펜 제약 Pty Ltd		수술 후 피부 자극과 가려움증을 줄이기 위해
럭시온 LED	필립스 조명 Co.		광 자극을 위해 Scope 소프트웨어로 제어되는 20개의 5와트 LED 및 1개의 1와트 LED
바늘 (거대 외과)	세계적인 정밀 기기	501959	복부 및 머리 봉합 수술, 3-0 봉합사, 눈 바늘, 절삭 날 5/16 서클 크기 1, 15mm와 함께 사용
바늘 홀더(대수술)	세계적인 정밀 기기	500224	복부와 머리 수술 중 바늘을 잡기 위해
바늘 홀더(미세 수술)	세계적인 정밀 기기	제555419NT	안구 수술 중 바늘을 잡기 위해
Optiva 카테터	스미스 메디컬 인터내셔널 LTD	16 또는 21 g	각막 활성 전극을 두개골에서 결막으로 안내
포비돈 요오드 10%	사노피-아벤티스	CAS 25655-41-8	소유명 : Betadine, 면도 한 피부를 수술 할 수있는 방부제 10 %, 500 mL
Powerlab 데이터 수집 시스템	광고	ML 785 (영문	텔레메트리 데이터 변환기와 쌍을 이루는 텔레메트리 송신기에서 신호 획득
프록시메타카인 0.5%	알콘 연구소	CAS 5875-06-9	국소 안구 진통
구속장치	쿠톰 메이드		구속기의 전면은 머리의 움직임을 최소화하기 위해 가늘어지며, 길이는 다른 쥐 길이를 수용하도록 조정할 수 있으며 전체 직경은 60mm입니다.
스케이프 블레이드	R.G. 의료 용품	SNSM0206	외과적 절개용
가위(거대외과)	세계적인 정밀 기기	501225	복부와 이마의 조직을 절단하기 위해
가위(미세수술)	세계적인 정밀 기기	501232	전극 부착을 위해 결막을 절개하기 위해
스코프 소프트웨어	광고	버전 3.7.6	ADI Powerlab 시스템을 통해 자극을 동시에 트리거하고 데이터를 수집합니다.
면도기	오스터	골든 A5	수술 부위의 털을 면도합니다
스테인리스 스트릴 나사	마이크로 패스너	L001.003CS304	샤프트 직경 0.7mm, 길이 3mm
입체식 프레임	데이비드 코프	모델 900	두개골에 이식 랜드마크를 찾기 위한 작은 동물 입체 기구
수술용 드레이프	필수 의료 용품	GM29-612EE	수술 중 멸균 환경 보장
봉합사(거대외과)	닌보 의료용 바늘	3-0	복부 및 두부 봉합 수술, 멸균 실크 브레이디드, 60cm
봉합침(미세수술)	닌보 의료용 바늘	8-0 또는 9-0	공막에 전극을 봉합하고 결막상처를 봉합하는 안구 수술, 나일론 봉합사, 3/8 서클 1×5, 30cm
텔레메트리 데이터 컨버터	데이터사이언스 인터내셔널	R08	텔레메트리 신호가 데이터 수집 소프트웨어와 인터페이스할 수 있도록 허용
텔레메트리 데이터 교환 매트릭스	데이터사이언스 인터내셔널		송신기에서 데이터를 수집하고 수신기와 페어링합니다.
텔레메트리 데이터 수신기	데이터사이언스 인터내셔널	RPC-1	송신기에서 텔레메트리 데이터를 수신합니다.
텔레메트리 송신기	데이터사이언스 인터내셔널	F50-EEE	3채널 텔레메트리 송신기
트로피카미드 0.5%	알콘 연구소		홍채 확장
핀셋(대수술)	세계적인 정밀 기기	500092	복부 및 머리 수술 중 조직 조작
핀셋(미세 수술)	세계적인 정밀 기기	500342	안구 수술 중 조직 조작

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