간질에 의한 쥐의 간질 발작에 대한 뇌파 기록

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 미세 투석 프로브 전극 장치의 조립

1. 3채널 2연전극(등록 전극의 절단 길이 이상이 20mm 이상이고 접지 전극 길이가 10cm 이상)을 사용하고 가이드 캐뉼러에 연결하여 장치를 준비합니다. 그림 1A-1B에서 투석을 위한 3채널 전극 및 가이드 캐뉼라의 예를 참조하십시오.
2. (숫자 1C)를 제거하고 (그림 1D) 동물에 있는 microdialysis 조사를 위한 그것의 스위치의 순간에 그것의 제거를 편하게 하기 위하여 사용법 전에 더미 플라스틱 캐뉼라로 금속 가이드 캐뉼라를 몇 번 삽입하십시오.
3. 레지스터 전극의 꼬인 와이어를 두 번 구부려 와이어를 가이드의 더미 캐뉼러와 정렬하고 전극 팁(그림 1G)을 가이드 캐뉼러의 팁(그림 1H)보다 0.5mm 길게 절단합니다(그림 1H).
4. 1mm 길이의 실리콘 서클릿(외경[OD] 2mm, 두께 0.3mm)을 준비하십시오. 그림 1I) 핀셋을 사용하여 가이드 캐뉼라의 끝과 꼬인 전극의 끝을 실리콘 서클릿에 삽입합니다(그림 1J). 빠른 작용의 폴리머 접착제 또는 수지로 가이드 캐뉼라 받침대의 발치에 고정합니다(그림 1K). 그림 1L 및 그림 2A에서 완성된 장치의 예를 참조하십시오.
5. 살균 자외선(UV) 광선 아래에서 장치를 4시간 동안 소독합니다.각 측면이 1시간 동안 빛에 노출되도록 장치를 네 번 뒤집습니다.
   메모: 많은 집에서 만든 전극과 미세 투석 프로브도 유사한 방식으로 조립될 수 있습니다. 상술한 랫드용 임플란트의 머리는 다음과 같은 치수를 갖는다: 7 mm 너비 x 5 mm 깊이 x 10 mm 길이, 상부로부터 받침대 발가락까지; 임플란트 팁은 길이 약 11mm, 직경 600μm이며 모든 장치 무게는 약 330-360mg입니다. (i) 다음 사용을 위해 수술하는 동안 두개골에 충분한 길이의 접지 전극이 남아 있고 (ii) 동물이 죽었을 때 장치를 치과 시멘트와 함께 회수하여 시멘트가 기계적으로 분해될 수 있도록 하룻밤 동안 아세톤에 남겨두었을 때, 장치를 2회 또는 3회 재사용할 수 있습니다. 그리고 장치를 세척하고 다시 살균했습니다.

2. 입체 수술

1. 무균 및 무통 수술에 대한 최신 표준에 따라 장치 이식을 위해 정위 장치 및 프로브 클립 홀더(그림 2B)를 사용하십시오.
   1. 성체 Sprague-Dawley 쥐를 케타민/자일라진 혼합물(43mg/kg 및 7mg/kg, 복강내 [i.p.])으로 마취하고 입체 프레임에 고정합니다. 초기 케타민/자일라진 주사에 이소플루란 마취제(공기 중 1.4%, 1.2mL/분)를 추가하면 마취 깊이를 적시에 제어할 수 있습니다. 동물의 머리에 있는 털을 면도합니다.
2. 요오드 기반 용액으로 머리 피부 표면을 면봉으로 닦은 다음 70% 에탄올을 주입하여 무균 수술을 준비합니다.
   1. 다음 좌표를 사용하여 우선 (1.1 – 1.5)으로 준비된 가이드 캐뉼러 전극 장치를 오른쪽 복부 해마에 이식합니다 : 코 막대 + 5.0 mm, A – 3.4 mm, L + 4.5 mm, P + 6.5 mm 브레그마. 정위 수술을 위한 표준 기술을 따르십시오.
   2. 고정 나사를 덮지 않는지 확인하십시오. 입체택시 장치에 장착할 때 프로브 홀더에 쉽게 정렬될 수 있으므로 가이드 캐뉼러 헤드용 장치를 잡으십시오.
3. 두개골 뼈에 나사로 고정하는 최소 4개의 스테인리스 나사(왼쪽 뼈에 나사 1개, 오른쪽 정면 뼈판에 나사 1개, 왼쪽 두정골에 나사 1개, 두정골 플레이트에 나사 1개). 조직 접착제 한 방울을 추가하여 각 나사를 두개골 뼈에 추가로 고정합니다.
   1. 나사산의 절반을 메타크릴 시멘트로 덮습니다. 접착력을 높이기 위해 뼈에 얕은 홈을 만들어 시멘트의 결합을 촉진합니다.
4. 장치의 끝이 뇌 조직에 배치되면 접지 전극의 와이어를 3개의 고정 나사로 꼬아줍니다. 장착된 모든 나사와 장치를 치과용 시멘트로 덮습니다.
5. 수술 중과 그 후 동물이 똑바로 서서 케이지 주위를 움직일 때까지 약 1시간 동안 동물을 모니터링합니다. 저체온증을 피하기 위해 보온 패드에 보관하십시오. 장치 이식 후 최소 7일 동안 쥐가 회복할 수 있도록 합니다.
6. 수술 후 3일 동안 적어도 하루에 한 번 동물에게 통증이나 고통의 징후가 있는지 모니터링하십시오. 감염을 예방하기 위해 절개 부위에 항생제 크림(겐타마이신 0.1%)을 바르고 수술 후 통증을 예방하기 위해 3일간 진통제(트라마돌 5mg/kg, i.p.)를 투
여합니다.

3. Pilocarpine에 의한 측두엽 간질 유도 및 실험 그룹에 동물 배정

1. 수술 후 일주일 동안 회복한 후, 동물을 그룹에 무작위로 배정합니다: (i) 차량을 받는 대조군 동물과 (ii) 필로카르핀을 투여할 간질 동물. 간질 그룹에 대해 비례적으로 더 많은 수의 동물을 사용하는데, 이는 필로카르핀을 투여한 모든 쥐가 이 질병에 걸리는 것은 아니기 때문이다.
2. 메틸스코폴라민(1mg/kg, 피하[s.c.])을 투여하고 30분 후 필로카르핀(350mg/kg, i.p.)을 1회 주사하여 간질(SE) 상태를 유도합니다. 메틸스코폴라민과 비히클(식염수)을 대조군 쥐에게 주입합니다. 모든 I.P. 투여에 25G 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하십시오.
   1. 동물이 행동 발작(5분 이내에 비브리사 이동, 고개 끄덕임, 팔다리 복제)을 시작하고 25분 이내에 몸 전체(SE)를 지속적으로 복제하기 시작하는지 육안으로 확인하십시오.
3. 발병 후 2시간 후에 SE를 정지시켜 약 25%의 사망률과 약 10일의 평균 잠복기를 갖도록 한다(20 mg/kg, i.p.). 필로카르핀 주사 직후 시작되는 모든 발작 행동을 관찰하고 기록하고 그 후 최소 6시간 동안 계속합니다.
4. 체중 감소의 회복을 촉진하기 위해 SE 후 2-3일 동안 25G 바늘이 있는 1mL 주사기와 자당 용액(1mL, p.o.)을 사용하여 1mL 주사기와 17G 바늘을 사용하여 동물에게 식염수(1mL, ip)를 제공합니다.
   1. 필로카핀 SE 후 첫 주 이내에 초기 체중에 도달하지 못한 동물은 연구에서 제외합니다(체중 추적이 불가능한 SE 후 24시간 후에 사망한 급성 그룹 제외).
5. SE 후 동물을 다른 실험 그룹에 무작위로 할당(그림 3): 급성기(SE 후 24시간 후에 미세 투석이 이루어짐), 잠복기(SE 후 7-9일), 첫 번째 자연 발작(SE 후 약 11일) 및 만성 기간(SE 후 약 22-24일 시작, 즉 첫 번째 발작 후 약 10일). 동물의 자연 발작 발생 여부를 모니터링합니다.
   메모: 간질성 쥐에 대한 추가 실험을 위해 다음 포함/제외 기준을 사용하십시오: 필로카르핀 투여 후 1시간 이내에 경련성 SE의 발달; SE 후 첫 주에 체중 증가와 미세 투석 프로브와 전극의 올바른 위치.

4. 간질 행동 모니터링 및 분석

1. 간질 행동에 대한 장기 모니터링
   1. 필로카르핀 투여 후 약 6시간 후(즉, 연구자의 직접 관찰이 끝날 때) 동물을 깨끗한 가정용 케이지에 넣고 24시간 비디오 모니터링을 시작합니다.
   2. 디지털 비디오 감시 시스템을 사용하여 5일차까지 24시간 비디오 모니터링을 계속합니다.
   3. 5일차부터 집 직사각형 케이지에 있는 쥐를 테더링된 EEG 기록 시스템에 연결하고 24시간 비디오 모니터링을 계속합니다.
   4. 패러데이 케이지 외부에 위치한 증폭기의 매개변수를 설정하고(각 단일 동물의 EEG 신호의 특이성에 따라 각 채널의 증폭 계수 설정) 연결되지 않은 케이블에서 생성되는 EEG 신호를 관찰하면서 EEG 수집을 시작합니다. 샘플링 속도가 200Hz이고 저역 통과 필터가 0.5Hz로 설정된 경우를 사용합니다.
   5. 한 손의 뻗은 두 손가락 사이에 동물의 머리를 잡고 다른 다른 손을 사용하여 커넥터를 전극 받침대에 나사로 고정하는 케이블에 동물을 연결합니다. 획득 시작.
      주의: 신호에 아티팩트가 없는지 확인합니다. 일반적인 아티팩트는 규모를 크게 초과하는 스파이크입니다.
   6. 미세투석 실험 하루 전, 미세투석을 위해 플렉시글라스 실린더가 장착된 테더형 EEG 시스템으로 동물을 옮깁니다. 가정용 케이지의 EEG 테더링 시스템에서 동물을 분리하고 동물을 구속하지 않고 전극에서 커넥터를 조입니다. 동물을 높은 플렉시 글라스 실린더에 넣습니다.

그림 1. 이식할 장치의 단계별 준비. (A) 왼쪽의 보호 슬리브에 10cm 길이의 접지 전극이 있는 3채널 전극, 장치 조립에 필요한 오른쪽의 미세 투석용 가이드 캐뉼라. (B). 벌거벗은 전극 및 가이드 캐뉼러를 자세히 설명합니다. 첫 번째 단계는 플라스틱 더미에서 금속 가이드 캐뉼라를 제거(C)하고 삽입(D)하여 동물의 머리에 이식된 후 쉽게 방출되도록 하는 것입니다. 두 번째 단계는 투석 가이드 캐뉼러(E, F)에 정렬되도록 꼬인 등록 전극을 두 번 구부리는 것입니다. (G) 전극 팁은 금속 가이드 캐뉼러의 팁보다 0.5mm 더 길게 절단해야 합니다. (H) 디지털 캘리퍼를 사용하여 절단의 정밀도를 확인하십시오. 그 후, 약 1mm 길이의 실리콘 서클릿을 사용하여 캐뉼라 피트(I)를 안내하기 위해 전극의 정렬을 고정해야 합니다. (J) 전극을 울리고 캐뉼라 샤프트를 안내하는 방법을 보여주는 사진. 마지막 단계는 가이드 캐뉼라 받침대에 수지 또는 접착제 한 방울을 떨어뜨려 실리콘 서클릿을 고정하는 것입니다(K). (L) 멸균 준비가 된 조립된 장치.

그림 2. 사용된 쥐의 미세투석-EEG를 위한 다양한 유형의 장치 사진(A) 및 이러한 장치를 이식하는 데 사용된 프로브 클립 홀더의 사진(B). (A) 가이드 캐뉼라(녹색)는 일반적으로 실험 24시간 전에 미세 투석 캐뉼라로 교체됩니다. 장치의 전기 커넥터(왼쪽 첫 번째는 이 원고에 설명된 녹음에 사용됨)를 통해 증폭기 및 데이터 수집 장비에 전기 신호를 전도하는 전선을 연결할 수 있습니다. 이 장치는 마취된 쥐의 두개골에 외과적으로 부착되며, 자유롭게 행동하는 쥐에게 통증이나 불편함을 주지 않고 나중에 녹음을 얻을 수 있습니다.

그림 3. 실험적인 디자인. 상태 간질(SE) 유도 일주일 전에 쥐에게 장치를 이식합니다. SE는 필로카르핀에 의해 유발되며 동물(투석되지 않고 SE 후 24시간에 죽임을 당한 경우, 급성 그룹의 쥐)은 5일 동안 비디오로 모니터링된 다음(파란색 선), 가정용 케이지(녹색 선)에서 발작 빈도와 지속 시간을 평가하기 위해 비디오-EEG를 모니터링합니다. 미세투석 실험을 위해, 간질 및 각각의 비간질 대조군 쥐는 미세투석 세션 24시간 전에 실린더 케이지가 장착된 다른 EEG 설정으로 옮겨지고 여전히 비디오 EEG가 모니터링됩니다(연한 녹색 선). 빨간색 세로선은 간질 질환 발병의 서로 다른 시점에서의 투석 세션을 나타냅니다. 가로선은 간질이 있는 동물(및 각각의 비간질 동물)의 다양한 그룹을 나타내며, 화살표는 미세 투석의 마지막 날과 동물이 죽은 날을 나타냅니다.