방법 논문

Recording Neuronal Field Excitatory Postsynaptic Potentials in Acute Hippocampal Slices(급성 해마 절편에서 신경 필드 흥분성 시냅스 후 전위)

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Weng, W., et al. 소량 재활용, 관류 및 수중 유형 챔버 시스템에서 유지되는 급성 해마 절편의 시냅스 가소성 기록. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 시냅스 활동을 기록하기 위해 침수실에서 뇌 절편을 설정하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 렌즈 종이에 슬라이스를 고정하고, 신경 세포의 생존력을 보장하기 위해 인공 뇌척수액(aCSF)의 지속적인 흐름을 유지하고, 관심 있는 특정 뇌 영역과 관련된 자극 및 기록 전극을 정확하게 배치하는 것이 포함됩니다. 이 설정을 통해 기준선 시냅스 활동과 전기 자극의 영향을 정밀하게 모니터링할 수 있습니다.

프로토콜

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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 침수 슬라이스 챔버에서 시냅스 반응 기록

참고: 재료 표를 참조하십시오.

  1. 수조에서 aCSF 용액을 약 28-30°C로 예열합니다(이렇게 하면 기록 챔버에서 기포 형성을 방지할 수 있음).
  2. 재활용 시스템(4-5mL/분)을 시작하고 인라인 히터를 활성화하여 최소 1시간 동안 시스템을 평형을 유지합니다.
  3. 작은 렌즈 청소용 종이 조각과 U자형 백금 와이어에 고정된 나일론 메쉬를 침수 슬라이스 챔버에 몇 분 동안 미리 담급니다(그림 1).
  4. U자형 백금선을 제거합니다.
  5. 재활용을 끄고 렌즈 청소지에 한 조각을 놓습니다.
  6. 즉시 슬라이스 홀딩 메쉬를 슬라이스 위에 놓고 펌프를 켠 다음 대물렌즈를 aCSF에 담그지 않고 슬라이스가 30분 동안 평형을 이루도록 합니다.
  7. 붕규산 마이크로피펫(즉, 기록 전극)에 aCSF(팁 저항: 1-2MΩ, aCSF로 1/3 충전)를 채우고 피펫 홀더에 장착합니다.
  8. 테스트된 에폭시 절연 텅스텐 자극 전극을 매니퓰레이터 홀더에 놓고 기준선을 슬라이스 챔버에 놓습니다.
  9. 챔버에 두 번째 기준 전극을 추가하고 기록 전극의 헤드 스테이지의 기준 소켓에 연결합니다(그림 1A).
  10. 증폭기 제어 소프트웨어에서 "제로 클램프 모드" 상자를 클릭하고 "출력 게인 목록" 상자를 두 번 클릭하여 진행합니다. 게인을 "100"으로 선택하고, "고역 통과 필터 목록 상자(Bessel)"를 두 번 클릭하고, "0.1Hz"를 선택하고, "저역 통과 필터 목록 상자(AC)"를 두 번 클릭하여 "3kHz"를 선택합니다.
  11. 녹음 소프트웨어에서 "Acquire | Open Protocol(개방형 프로토콜)"을 선택하십시오.50-100ms 동안 10-20kHz에서 에피소드 자극 및 증폭된 전위의 디지털화를 허용하는 설정이 있고 에피소드 기록 시작 10ms 후 자극 아이솔레이터를 자동으로 트리거하는 프로토콜을 선택합니다.
  12. 예를 들어, 자극 및 기록 전극을 피라미드층과 일직선으로 평행하게 배치합니다(그림 1B 및 그림 2).
  13. "Acquire (획득) | Edit Protocol(프로토콜 편집)"을 선택하고 팝업 창에서 "trigger(트리거)" 탭을 선택합니다. "트리거 소스" 상자를 클릭하고 트리거 소스로 "스페이스 바"를 선택합니다. "확인" 버튼을 클릭합니다. "record(기록)" 버튼을 클릭하여 획득을 시작하고 트리거 버튼이 있는 팝업 창을 확인합니다.
  14. 자극 아이솔레이터 소프트웨어에서 "전압 제어" 상자를 클릭하고 "0"을 입력합니다. "다운로드" 버튼을 클릭합니다. "녹음 소프트웨어" 창을 클릭하고 스페이스 바를 누릅니다. 예를 들어 "전압 제어" 상자에 1mV 단계에서 1에서 8까지의 값을 순차적으로 입력하여 이 주기를 반복합니다.
  15. 자극 강도를 fEPSP-기울기 값과 연관시키고 fEPSP-기울기 최대값의 40%를 얻는 데 필요한 자극 강도를 결정합니다. "전압 제어 상자"를 클릭하고 결정된 값을 입력합니다. "다운로드" 버튼을 클릭합니다.
    메모: 자극 아이솔레이터는 뇌 조직에 짧은 전압 또는 전류 펄스를 인가하는 데 사용됩니다. 바이페이식 펄스는 위상당 100μs를 가질 수 있습니다.
  16. 녹음 소프트웨어에서 중지 버튼을 클릭한 다음 "Acquire" 메뉴를 클릭합니다. "프로토콜 편집"을 클릭하고 팝업 창에서 "트리거" 탭을 선택합니다. 트리거 소스 상자를 클릭하고 "내부 타이머"를 트리거 소스로 선택합니다. "확인" 버튼을 클릭합니다. 예를 들어, 30초마다 필드 전위의 자동 기록을 시작하는 기록 버튼을 클릭합니다. 30-60분 후에 "중지" 버튼을 클릭합니다.
  17. "Acquire" 메뉴를 클릭하고, "Open Protocol"을 클릭하고, 원하는 시냅스 가소성 유도 프로토콜을 선택하고, "OK" 버튼을 클릭합니다. "녹음" 버튼을 클릭하면 고주파 자극 및 녹음이 자동으로 활성화됩니다. "중지" 버튼을 클릭합니다.
    메모: 시냅스 가소성과 관련된 연구의 경우, 장기간의 기준선 기록 후 장기 강화(long-term potentiation) 또는 장기 우울증(long-term depression)에 대한 표준 유도 패러다임 중 하나를 적용한다. 시냅스 전달의 결과적인 조절의 대표적인 예가 그림 4 및 그림 5에 나타나 있습니다.
  18. 녹음 소프트웨어에서 "Acquire | Open Protocol(프로토콜 열기)"을 선택하고 4.12단계와 동일한 프로토콜을 선택합니다. "확인" 버튼을 클릭한 다음 "녹음"을 클릭합니다.예를 들어, 2-4시간 동안 필드 전위 녹음을 자동으로 계속 실행합니다. "중지" 버튼을 클릭하여 녹음을 종료합니다.
  19. 제약 연구의 경우, 영구적인 화합물 투여가 필요한 경우 화합물을 aCSF 저장소에 직접 도포합니다(그림 3).

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결과

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그림 1: 침수 슬라이스 챔버에서의 실험을 위한 유출-탈광의 구성 요소. (A) 침수 슬라이스 챔버의 프레젠테이션. 해마 조각을 잡고 있는 나일론 섬유가 있는 U자형 백금 와이어가 묘사되어 있습니다. 은선은 작은 캐뉼라를 감싸고 은선 끝부분의 면적을 늘리기 위해 코일을 만들었습니다. 자극 참조 와이어는 유출 챔버에 배치되었고, 기록 참조는 메인 챔버에 있었습니다. 서로 다른 액체 레벨에서 기준 전극 전위를 안정적으로 유지하기 위해 기록 참조 와이어는 플라스틱 튜브로 절연될 수 있으며 버퍼에 노출된 와이어의 "수중" 부분만 남길 수 있습니다. (B) 명시야 이미지는 대표적인 급성 해마 절편과 전극을 보여줍니다. CA1, CA3: 코르누 암모니스 1, 3; DG ...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
전기생리학, 장비 및 재료
수직 피펫 풀러Narishige, 일본PC-10
방진 테이블Meirits, 일본ADZ-A0806
수중형 녹음실워너 인스트루먼트RC-26GLP
온도 조절 수조Zhongcheng Yiqi, 중국HH-1
4 축 MicromanipulatorSutter, 미국MP-285, MP-225
플래티넘 와이어세계적인 정밀 기기PTP406
증폭기Molecular Devices, 미국멀티클램프 700B
데이터 수집 시스템Molecular Devices, 미국디지데이터 1440A
Anaysis 소프트웨어Molecular Devices, 미국클램프 10.2
형광 현미경Nikon, 일본에프엔1
LED 광원Lumen Dynamics Group, 캐나다엑스 인용 120LED
마이크로피펫하버드 기구GC150TF셀룰러 외 레코딩
붕규산 마이크로피펫Sutter, 미국BF150-86패치 클램프
텅스텐 전극A-M Systems, 미국575500
연동 펌프Longer, 중국BT00-300티
연동 펌프용 튜브ISMATEC, 베르트하임, 독일SC03091x 유입, ID: 1.02mm
연동 펌프용 튜브ISMATEC, 베르트하임, 독일SC0319유출용 튜브 2개, ID: 2.79 mm
CCD 카메라PCO, 독일pco.edge sCMOS
렌즈 청소지코닥
50ml 원추형 원심분리기 튜브써모 사이언티픽339652
프리챔버워너 인스트루먼트BSC-PC
인라인 히터워너 인스트루먼트SF-28
온도 조절기워너 인스트루먼트TC-324B
필요한 시약
염화나트륨Sinopharm 화학 시약,
중국		10019318
케이클Sinopharm 화학 시약,
중국		10016318
KH2사서함4Sinopharm 화학 시약,
중국		10017618
마그네슘2·6H2OSinopharm 화학 시약,
중국		10012818
염화칼슘2Sinopharm 화학 시약,
중국		10005861
나HCO3Sinopharm 화학 시약,
중국		10018960
포도당Sinopharm 화학 시약,
중국		10010518
나H2PO4Sinopharm 화학 시약,
중국		20040718
헤페스 시그마 H3375 (영문
나트륨 피루브산 시그마 A4043
재질 보기 MgSO4Sinopharm 화학 시약,
중국		20025118
나오Sinopharm 화학 시약,
중국		10019718
시리즈 (영어) 시리즈 )

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

field EPSP

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