신생아 설치류의 뇌간-척수 제제의 전기생리학적 기록

초록

출처: Rousseau, J., et al. 전기생리학은 신생아 설치류의 고립된 뇌간-척수 제제에 대한 신경 호흡 네트워크 출력 기록을 허용합니다. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 갓 태어난 설치류의 분리된 뇌간-척수 제제의 전기생리학적 기록을 보여줍니다. 제제는 기록실에 넣고, 뇌간의 흡기 폭발은 척수의 네 번째 복부 신경근을 사용하여 산소가 공급되고 산소가 부족한 상태에서 기록됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 설정 및 준비

1. 솔루션
   1. 다음 레시피에 따라 인공 뇌척수액(aCSF) 원액을 준비합니다. 농도 변화가 있는 다른 조리법은 문헌에서 사용할 수 있습니다. 재고 용액을 4°C에서 최대 한 달 동안 보관하십시오.
      1. 염 용액 : NaCl 75.39g (최종 129mM), 2.5g의 KCl (3.35 mM 최종), 0.81g의 NaH₂PO4 (0.58 mM 최종), 2.33g의 MgCl₂ (1.15 mM 최종), 1.85g의 CaCl₂ (1.26 mM)를 첨가한다. 증류수 800ml에 녹인 다음 증류수를 1L까지 채웁니다.
      2. 중탄산염 용액 : 17.65g의 NaHCO₃ (21 mM 최종)를 첨가합니다. 증류수 900ml에 녹인 다음 증류수를 1L까지 채웁니다. 중탄산염 농도의 변화는 pH 변화를 초래합니다.
      3. 포도당 용액 : 포도당 54.06g을 첨가합니다 (최종 30mM). 증류수 400ml에 녹인 다음 증류수를 500ml까지 채웁니다.
   2. 증류수 1L에 염수 100ml, 중탄산염 용액 100ml, 포도당 용액 50ml를 희석하여 aCSF를 준비합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
   3. 유리관이 깨질 때까지 유리관을 데우고 늘려 유리 전극을 준비합니다. 사용하기 전에 팁을 사포로 닦으십시오. 전극은 깨끗하게 유지되는 한 여러 번 재사용할 수 있습니다.
2. 실험적 설정
   메모: 설정 세부 정보는 그림 1에 나와 있습니다.
   1. 증폭기, 이동 평균기, 데이터 수집 시스템, 온도 컨트롤러 및 펌프를 켭니다. 신호 증폭(게인 = 10,000), 여과(낮은 임계값, 10Hz, 높은 임계값, 5kHz) 및 원시 신호의 아날로그-디지털 변환(2.5kHz)의 샘플링 속도를 확인합니다.
   2. 병에 CSF를 채우고 탄수화물(95% O₂, 5% CO₂)로 거품을 냅니다. 기록 챔버(볼륨 5ml)에서 4ml/분의 속도로 기포 및 가열된 aCSF 흐름을 유도합니다. 기록 챔버의 온도를 26(± 1) °C로 유지합니다. 이러한 표준 조건에서 pH는 7.4여야 합니다.
   3. 실온(RT) 50ml와 발암물질로 기포된 aCSF를 50ml 주사기에 넣어 박리실 근처에 보관합니다.
   4. 컴퓨터를 켜고 녹음 소프트웨어를 시작합니다.

2. 해부

1. 무게를 측정하고 육안으로 동물의 성별을 결정합니다(수컷은 무향 생식기 거리가 더 긴 반면 암컷은 무상 생식기 거리가 짧습니다. 남성 생식기는 종종 어둡고 여성 생식기는 분홍색입니다).
2. 다음 옵션 중 하나로 갓 태어난 설치류를 마취합니다: 냉동 마취(동물을 4 – 5분 동안 얼음에 완전히 담그기), 주사(4ml/kg의 에퀴텐신) 또는 휘발성 마취제(이소플루란 또는 에테르) 흡입. 발 철수 반사가 없는 상태에서 적절한 마취 평면을 확인합니다.
3. 동물을 복부가 아래로 향하게 하여 벤치에 놓습니다. 머리의 부분을 브레그마 수준(피부와 두개골을 통해 볼 수 있음)에서 메스로 관상으로 절단합니다. 동물을 마취한 직후 이 단계를 수행하십시오.
4. 앞쪽 부재 아래에 메스로 몸을 관상으로 절단합니다.
5. 수술용 가위와 얇은 가위와 펜치로 피부, 근육, 지방 조직 및 점성을 제거합니다. 이 나이는 뼈가 부드럽기 때문에 신경계가 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 벤치에서 이 단계를 수행합니다.
6. 제제를 해부실에 놓습니다. 주사기에 저장된 aCSF를 사용하여 제제에 산소를 공급합니다. 이 시점부터 녹음이 끝날 때까지 현미경을 사용하십시오.
7. 제제의 등쪽 얼굴에서 수술용 얇은 가위와 펜치로 중간 축을 따라 두개골에서 꼬리 부분까지 두개골과 척추를 자릅니다. 신경 조직을 노출시키기 위해 절단된 두개골과 척추를 엽니다. 주사기에 저장된 aCSF를 사용하여 제제에 산소를 공급합니다.
8. 펜치로 신경 조직의 표면을 덮고 있는 얇은 조직인 지주막을 제거합니다. 신경 조직에 대한 pia mater와 혈관을 유지하십시오. 주사기에 저장된 aCSF를 사용하여 제제에 산소를 공급합니다.
9. 등쪽이 아래를 향하도록 제제를 놓고 제제를 제자리에 고정한 상태에서 가위로 신경과 결합 조직을 잘라 뇌간과 척수를 조심스럽게 아래로 내립니다. 등쪽 접근 방식도 가능합니다. 뿌리와 신경을 가능한 한 오래 유지하십시오. 뼈를 제거하여 뇌간과 척수를 분리합니다. 주사기에 저장된 aCSF를 사용하여 제제에 산소를 공급합니다.
10. 소뇌와 남아 있는 배부 구조를 메스로 절편하여 제거합니다. 바늘에 저장된 aCSF를 사용하여 제제에 산소를 공급합니다.
11. 선택적으로 실험 설계에 따라 하소뇌 동맥 앞쪽의 관상 단면부로 메스로 폰을 제거합니다. 전체 폰을 유지하면 쥐의 리듬이 느려지고 쥐의 리듬이 완전히 억제됩니다. 폰즈의 꼬리 부분만 포함하는 제제는 C4 뿌리에서 안정적인 빈도로 호흡기와 같은 활동을 나타냅니다.

3. 녹음

1. 배쪽이 위를 향하도록 하여 준비물을 녹음실에 놓습니다. 척수의 가장 낮은 부분과 뇌간의 가장 낮은 부분에 핀으로 준비물을 고정합니다.
2. 바늘로 전극에 연결된 주사기를 사용하여 주사기 피스톤을 당겨 전극에 함몰(유리 팁 직경: 150 - 225 μm)을 유도하여 전극에 aCSF를 부분적으로 채웁니다.
3. micromanipulator를 사용하여 전극을 네 번째 복부 뿌리 중 하나에 가깝게 조심스럽게 놓습니다. 다른 복부 뿌리도 호흡기와 유사한 활동을 나타낼 수 있습니다(예: XII 뇌 신경, C1 복부 뿌리).
4. 주사기를 통해 전극 탱크의 함몰을 유도하기 위해 피스톤을 당겨 신경 뿌리를 부드럽게 흡인합니다. 그런 다음 전극을 조심스럽게 움직여 척수에 적용합니다.
   메모: 이상적으로는 뿌리의 크기가 전극 개구부의 크기와 일치하여 전극의 내부 및 외부 구획 사이에 밀봉을 생성합니다. 이러한 녹음에는 차동 증폭기가 일반적으로 사용되기 때문에 전극 내부와 기록 챔버 사이에 구멍이 생기면 신호 품질이 저하되고 배경 잡음을 제거하기 어려워집니다.
5. 녹음을 시작합니다.
6. 규환 조건(즉, 발암물질로 거품이 일어난 aCSF: 95%_O2 및 5% CO₂)에서 제제에 의해 생성된 리듬을 최소 20분 동안 기록하여 제제의 기준선 매개변수를 결정합니다.
7. 15분 동안 관류를 발암물질 기포형 aCSF에서 자극 aCSF(즉, 저산소증 자극의 경우 95% N₂ 및 5% CO₂로 기포)로 전환합니다. 실험 프로토콜에 따라 노출 기간을 변경합니다. 녹화 및 동물 데이터시트에 노출 시간을 기록하십시오. 가능하면 aCSF 병과 챔버 사이에 스테인리스 스틸 튜브를 사용하여 튜브가 튜브 외부로 확산되는 것을 방지하십시오.
8. 회복 기록을 위해 최소 15분 동안 관류를 표준 발암제 버블 aCSF로 다시 전환합니다. 이를 기록 및 동물 데이터시트에 기록하십시오.
9. 녹음을 종료합니다.

결과

그림 1. 설정의 반복 스키마.기포가 형성된 aCSF는 가열되어 기록 챔버의 펌프에 의해 보내집니다. 기록 챔버 내의 과잉 CSF는 펌프에 의해 흡인되어 폐기됩니다. 기록 챔버는 접지 및 온도 컨트롤러에 연결됩니다. 전극 출력은 증폭기로 직접 중계된 다음 이동 평균기와 데이터 수집 시스템, 마지막으로 컴퓨터로 중계됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
실가드	시그마 알드리치	761036-5개	후드 아래에서 사용
염화나트륨	바이오샵	SOD002
케이클	바이오샵	POC888
염화칼슘2	바이오샵	CCL444
재질 보기 MgCl2	바이오샵	매그510
나HCO3	바이오샵	SOB999
나H2PO4	바이오샵	SPM306
D-포도당	바이오샵	GLU501
카보겐	린데	Tel.: 343-02-0006
온도 조절기	Warner Instruments, 미국 코네티컷주 햄든	TC-324B
흡입 전극	AM Systems, 미국 워싱턴주 에버렛	모델 573000
차동 AC 증폭기	AM Systems, 미국 워싱턴주 에버렛	모델 1700
이동 평균자	CWE, 아드모어, 펜실베니아, 미국	모델 MA-821
데이터 수집 시스템	Dataq Instruments, 미국 오하이오주 애크런	모델 DI-720
LabChart 소프트웨어	ADInstruments, 콜로라도 스프링스, 콜로라도, 미국
프리즘 소프트웨어	Graphpad, 라호야, 캘리포니아, 미국
녹음실	집에서 만든
기지	Kanetec, 미국 일리노이주 벤슨빌
마이크로 매니퓰레이터	World Precision Instrument Inc, 미국 플로리다주 새러소타	메가바이트
기지	Kanetec, 미국 일리노이주 벤슨빌	카이트-R
연동 펌프	Gilson, Middleton, 위스콘신, 미국	메가바이트
패러데이 케이지	집에서 만든	미니펄스 3
컴퓨터

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