설치류 새끼의 장기 연속 뇌파 모니터링

초록

출처: Zayachkivsky, A. et al. Epoch Wireless Transmitter System을 사용한 인간 질병의 소형 설치류 모델에서 장기 연속 EEG 모니터링. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 무선 송신기 시스템을 사용하여 설치류 새끼의 장기 연속 뇌파검사(EEG) 모니터링을 보여줍니다. 송신기에는 두 개의 기록 전극과 뇌 표면까지 확장되는 하나의 기준 전극이 포함되어 있습니다. 강아지를 기록실에 넣으면 강아지가 성인으로 발달하는 동안 EEG를 지속적으로 모니터링할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술 준비

1. 안전하고 멸균된 수술을 보장하기 위해 송신기를 청소하고 준비하십시오. 정전기 방지 포장에서 트랜스미터를 제거하고 70% 에탄올을 스프레이하거나 담그십시오. 트랜스미터를 멸균 식염수로 헹구고 멸균 식염수에 적신 멸균 면 스펀지 사이에 놓거나 멸균 식염수에 담근 상태로 유지합니다.
2. 수술에 필요한 도구를 수집하고 살균하고, 살균을 위해 증기 오토클레이브를 사용하십시오. 수술 도구 목록은 재료 및 시약 표를 참조하십시오.

2. 외과적 임플란트

1. IACUC 승인 프로토콜에 따라 동물을 마취하고 마취를 유지합니다. 시작 시와 수술 중에 15분마다 발가락 꼬집기 반사를 확인하십시오. 반응이 없다는 것은 충분한 수준의 마취를 나타냅니다.
   1. 강아지의 경우 O₂(100%)와 함께 이소플루란(4%)에 의한 마취를 사용합니다. 성인의 경우 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 함께 사용하십시오.
2. 입체식 프레임의 위치를 고정합니다. 이어바 끝을 청각 고기에 놓습니다. 어린 쥐 새끼의 두개골은 매우 부드럽기 때문에 이어바를 과도하게 조이지 마십시오. 마취 노즈 콘을 고정합니다.
   1. 37°C로 설정된 발열 패드에 올려 수술 중 동물을 따뜻하게 유지하십시오. 성체 동물의 경우 동물의 눈에 윤활 연고를 바르십시오.
3. 절개 부위를 살균하고 무균 수술 부위를 유지합니다.
   1. 70% 에탄올과 베타딘을 번갈아 가며 두피를 면봉으로 닦습니다. 두피 중앙에서 시작하여 점점 더 넓은 동심원을 만듭니다.
   2. 동물을 드레이프로 덮고 드레이프된 동물 위에 수술을 진행합니다. 멸균 커튼, 스프레이 장비에 70% 에탄올을 주입하여 수술 환경을 멸균 수술 구역을 유지합니다.
   3. 멸균 수술용 장갑과 가운을 착용하십시오(또는 기관에서 요구하는 대로). 멸균 영역을 유지하려면 수술 보조원을 사용하십시오.
4. 정중선을 따라 눈 약간 뒤에 있는 동물의 두피를 약 2cm 정도 절개합니다. 메스를 삽입할 때 주의해야 하는데, 어린 새끼 쥐의 두개골은 여전히 매우 부드럽기 때문입니다. 절개 부위에서 출혈이 적고 더 빨리 치유되도록 한 번 절개하십시오.
5. 두개골을 노출시킵니다. 송신기와 두개골 뼈 사이의 결합을 최대화하기 위해 깨끗하고 건조한 영역을 준비하십시오. 동맥류 클립을 사용하여 두피를 잡습니다.
   1. 두피를 네 모서리의 정중선에서 부드럽게 잡아당깁니다. 두개골에서 브레그마(bregma)와 람다(lambda)와 같은 해부학적 랜드마크를 찾으십시오. 이 나이의 동물에서는 두개골 뼈가 융합되지 않는다는 것을 기억하십시오. Paxinos 입체 좌표 아틀라스를 사용하여 버 구멍의 올바른 위치를 찾습니다.
6. 버 유형 드릴 비트와 함께 Dremel 유형 공구를 사용하십시오. 직경이 300μm보다 큰 구멍으로 원하는 기록 위치에 두 개의 버 구멍을 만듭니다. 기준 전극을 위한 버 구멍을 두개골의 람다 뒤에 있는 소뇌 위에 놓습니다.
7. 송신기의 전선이 버 구멍과 정렬되어 있는지 확인하십시오. 전극선이 정렬되지 않으면 전극의 접착제 오염이 발생할 수 있으며 신호가 좋지 않습니다. 전선을 정렬하려면 송신기의 적합성을 확인하고 전극을 부드럽게 구부려 버 구멍이 있는 의도된 위치에 정렬합니다.
8. 전극 리드를 다듬습니다. 수술용 가위를 사용하여 전극을 원하는 길이로 자릅니다. 전극 깊이는 실험에 필요한 기록 유형에 중요합니다(즉, EEG 기록을 위해 전극을 경막 위에 배치하거나 정의된 뇌 구조를 위해 입체 좌표를 사용).
9. 송신기 바닥에 시아노아크릴레이트를 자유롭게 도포하여 전극이 코팅되지 않도록 해당 영역을 덮습니다. 시아노아크릴레이트 접착제는 전기 절연체이며 접착제로 전극을 오염시키면 신호가 발생하지 않습니다.
   1. 뇌 심부 구조에서 녹음하는 경우 송신기를 캐뉼라 홀더에 장착하고 z축 제어를 위해 입위 암에 배치합니다. 입체식 암을 사용하여 트랜스미터를 적절한 깊이로 내리고 트랜스미터 주위에 시아노아크릴레이트 겔을 놓습니다.
10. 강력한 접착 결합을 보장하기 위해 송신기를 배치하기 전에 두개골을 완전히 말리십시오. 시아노아크릴레이트로 코팅된 송신기를 두개골에 바릅니다. 전극을 해당 버 구멍에 정렬하도록 주의하십시오.
    1. 주요 혈관 구조가 손상되지 않도록 하십시오. 1분 동안 약간의 압력으로 송신기를 제자리에 잡습니다. 송신기와 두개골 사이에 강한 유대감을 형성하기 위해 약간의 압력을 가하십시오.
11. 송신기/두개골 계면을 완전히 밀봉하기에 충분한 시아노아크릴레이트를 추가로 도포합니다. 좋은 착용감과 강한 접착력을 보장하려면 두개골과 접촉하는 접착제의 표면적을 최대화하십시오. 송신기 주위에 cyanoacrylate 접착제를 원을 그리며 바르고 두개골과 송신기의 벽이 모두 덮여 있는지 확인합니다.
12. 주입된 전달물질 기저부에 있는 시아노아크릴레이트 주위에 주사기를 통해 화학적 촉진제(0.1ml)를 도포합니다. 촉진제는 인접 조직에 바르지 않도록 주의하면서 가급적 사용하지 마십시오.
    메모: 시아노아크릴레이트 경화의 화학적 가속은 송신기와 두개골 사이에 강한 결합이 빠르게 형성되도록 합니다. 시아노아크릴레이트 촉진제는 접착제의 경화를 가속화하는 데 유용하지만 반드시 필요한 것은 아닙니다.
13. 멸균 식염수로 해당 부위를 철저히 세척하여 촉진제를 제거하십시오. 시아노아크릴레이트 촉진제는 절개 부위를 씻어내지 않으면 조직 자극을 유발할 수 있습니다. 해당 부위를 세척하려면 1.0ml 주사기에 멸균 식염수를 채우고 주사기 바늘을 통해 해당 부위를 세척합니다. 일반적으로 식염수 0.5ml는 촉진제를 씻어내기에 충분합니다.
14. 송신기 바닥 주위의 피부를 봉합하되 송신기를 덮지 마십시오. 신경 신호를 효율적으로 전달하기 위해 송신기의 상단이 피부 위에 있어야 합니다. 피부는 송신기 주위와 장치 주위의 접착제 주위가 적당히 조여져야 합니다. Vicryl 또는 실크 봉합사(부드러운 실)를 사용하십시오. 미성숙 동물의 피부는 부드러워서 부드러운 봉합사를 사용하지 않으면 쉽게 손상됩니다. 성인 동물의 경우 봉합 재료를 사용하십시오.
15. 입체 안경테에서 동물을 제거하고 회복을 위해 가열된 담요 위에 놓습니다.
16. 댐으로 돌아가기 전에 동물들이 따뜻하고(37°C) 보행할 수 있는지(즉, 완전히 회복되었는지) 확인하십시오. 동물의 등 피부를 꼬집어 동물이 수분을 공급받았는지 확인합니다(동물이 탈수되면 피부가 변형된 상태로 남습니다). 동물이 탈수 상태인 경우 젖산 링거 완충액을 피하 주사합니다. 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
    1. 수술 후 통증 관리를 위해 동물에게 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 투여하고 주사 부위 주위에 0.1ml 부피바카인을 피하 주사합니다.
       메모: 처음부터 끝까지 이 연령대의 동물의 경우 전체 절차를 5-10분 안에 완료해야 합니다(출생 후 6일차). 나이가 많은 동물의 경우 수술 시간이 더 오래 걸릴 수 있습니다.

3. 간호 및 주택

참고: 일부 댐은 장치를 이식한 강아지를 용납하지 않을 수 있습니다. 관대한 댐을 선택해야 할 수도 있습니다. 댐이 송신기에 의해 새끼를 집어 올려 케이지 주위로 이동하는 것은 허용됩니다.

1. 동물이 젖을 떼면 케이지 짝에서 장치가 제거되는 것을 피하기 위해 단독으로 수용하십시오.
2. 고통의 징후가 나타날 때 펜토바르비탈(25mg/kg) 또는 이소플루란(벨 항아리에 담겨 있음)을 치사량으로 동물을 안락사시킵니다.
3. 참고: 와이어 인서트가 있는 일부 동물 사육 케이지는 이식된 송신기를 방해할 수 있습니다.와이어 인서트의 높이를 확인하여 동물이 와이어 인서트의 '막대' 사이에 송신기가 끼이지 않도록 하십시오.

4. EEG 기록

1. 동물을 우리에 단독으로 넣거나 새끼 동물과 댐과 함께 수용하십시오. 그러나 하나의 케이지에 이식된 동물을 한 마리만 넣으십시오. 녹음실에 강아지를 2시간 이상 혼자 두지 마십시오. 동물에게 고통과 탈수 징후가 있는지 모니터링하십시오.
2. 제공된 전원 공급 장치를 수신기 베이스에 연결하고 전원 표시등이 켜져 있는지 확인합니다. BNC(Bayonet Neil-Concelman) 케이블을 사용하여 수신기 베이스를 데이터 수집 시스템에 연결합니다.
3. 동물 케이지를 수신기 베이스 위에 놓습니다(그림 1). 송신기가 감지되었음을 나타내는 "신호" 표시등이 켜져야 합니다. 이제 데이터를 기록할 수 있습니다.
4. 데이터를 기록하려면 수신기 베이스를 아날로그-디지털 컨버터에 연결하고 컨버터를 컴퓨터에 연결합니다(그림 2).
5. 녹음의 샘플링 속도를 설정합니다. 데이터가 제대로 샘플링되었는지 확인합니다. 최소 250Hz 선택amp녹음을 위한 링 속도(500Hz 권장)를 선택합니다(송신기의 대역폭은 0.1-100Hz).
6. 디지털화된 데이터를 저장하고 Matlab과 같은 신호 처리 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석할 수 있습니다.

결과

그림 1: 송신기와 수신기. 이 특정 무선 송신기(A)는 무게가 4g이고 부피가 <1.4cm3이며 7 x 12mm의 설치 공간으로 쥐와 생쥐의 두개골에 쉽게 장착할 수 있습니다. 송신기는 최대 6개월 동안 2개의 생체 전위 채널을 증폭할 수 있으며, 그 후 배터리가 방전됩니다. 더 큰 배터리를 사용하면 더 긴 녹음 시간을 보낼 수 있습니다. 동물은 Epoch 수신기 (B) 상단의 표준 설치류 케이지에 배치됩니다. 오른쪽에는 각각 16마리의 동물을 동시에 녹음할 수 있는 두 개의 개별 녹음 리그의 초기 예가 나와 있으며, 각 녹음 리그의 상대적으로 작은 설치 공간(2' x 4', 약 60cm x 120cm)을 보여줍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
멸균 수술용 장갑	산업용 보호용품	100-3201 PF	파우더 프리 멸균 라텍스 수술 장갑
메스 손잡이	증권 시세	10003-12
메스 블레이드 #15	증권 시세	10015-00
파인 가위	증권 시세	14090-09
버 도구	램 제품, Inc.	마이크로 토크 II
미세한 버	증권 시세	19007-07
동맥류 클립	로보즈	RS-5422
이빨 겸자	증권 시세	11022-14
코튼 팁 애플리케이터	맥케슨	24-103
니들 드라이버	WPI (영어)	521725	Olsen-Hegar 바늘 홀더
시아노아크릴레이트 겔	헨켈	록타이트 4541
시아노아크릴레이트 촉진제	헨켈	록타이트 7452
봉합 사	에티콘	비트릴 RB-1 J304
일회용 Elecrocautery	보비	AA01	파인 팁
수술용 트레이	증권 시세	20311-21
Epitel 수신기 베이스	에피텔 Inc	해당 사항 없음
Epitel 무선 송신기	에피텔 Inc	해당 사항 없음
Biopac 디지타이저	바이오팩	MP-150
PC 호환 컴퓨터

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