해마 뇌 절편에서 테타닉 자극을 사용하여 국소 cornu ammonis 1 (CA1) 감마 진동 생성

초록

출처: Hatch, RJ, et al. 파탄 자극에 의한 국소 Ca1 γ 진동의 생성. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 테타닉 시뮬레이션을 사용하여 CA1 해마 마우스 뇌 절편에서 국소 CA1 감마 진동을 유도하는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 뉴런 네트워크 활동을 이해하는 데 중요합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. Brain Slices 절단 설정

1. (mM) 125 콜린-Cl, 2.5 KCl, 0.4 CaCl₂, 6 MgCl₂, 1.25 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 20 D-포도당 포화 (95% O₂–5% CO₂) 및 (mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl₂, 2 MgCl₂, 1.25 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 10 D-포도당, 발암원으로 포화. 절단 용액을 얼음 위에 올려 차갑게 유지하십시오.
2. 절단 용액 약 400ml를 얼리고 얼지 않은 절단 용액 100ml와 함께 혼합하여 얼음 슬러리를 만듭니다. 소구경 튜브 또는 소결 유리를 통해 약 0.5L/min의 흐름으로 탄소(95% O₂–5% CO₂)로 기포를 만들어 안정적이지만 부드러운 기포 흐름을 생성합니다.
3. 뇌 조각을 놓을 돌출된 나일론 메쉬 인서트가 있는 250ml 비커를 준비합니다. 메쉬를 약 2cm 덮도록 aCSF로 채우고 기포가 슬라이스 고정 영역을 직접 방해하지 않도록 발암제로 거품을 일으킵니다. 나일론 메쉬에 기포가 없는 것도 중요하므로 기포가 있으면 제거하십시오. 이것은 홀딩 챔버가 될 것이며 RT (20 - 25 ° C)로 유지됩니다.
4. 큰 가위, 작은 가위, 크고 큰 마이크로 주걱, 크고 작은 집게를 포함한 해부 도구를 배치하고 얼음 위에서 식힙니다. 비브라톰 티슈 절단 블록을 알루미늄 호일 사각형 위의 얼음 위에 놓습니다. 2cm 여과지 6장, 단면 면도날, 절단 용액 슬러리로 채워진 25ml 비커도 구합니다.
5. 두 번째 용기에 얼음을 채우고 얼음 위에 티슈 페이퍼를 놓고 그 위에 12cm 배양 접시를 놓습니다. 배양 접시에 절단 용액, 얼음 슬러리, 발탄제로 거품을 채웁니다. 이것은 뇌 해부가 수행되는 용기입니다.
6. 비브라톰을 준비합니다. 포장에서 새 양날 면도날(매번 새 면도날 사용)을 제거하고 80% 에탄올을 뿌린 다음 탈이온수를 뿌립니다. 가늘어지기 시작하는 지점에서 3ml 플라스틱 전사 피펫을 자릅니다. 이것은 뇌 조각을 전송하는 데 사용됩니다. 27G 바늘의 바닥을 약 45° 구부린 후 1ml 주사기에 부착합니다. 이것은 절단하는 동안 슬라이스를 조작하는 데 사용됩니다.

2. 뇌 슬라이스 자르기

1. 마우스(P16-P18)를 2% 이소플루란 또는 현지에서 승인된 방법으로 마취합니다. 유도 후 큰 가위로 동물의 목을 자르고 거품이 있는 절단 용액 슬러리가 들어 있는 12cm 배양 접시에 머리를 떨어뜨립니다. 슬러리는 급속 냉각을 위해 헤드를 완전히 잠겨야 합니다.
2. 한 손으로 머리 앞쪽을 잡고 피부와 결합 조직을 코 쪽으로 앞으로 벗겨냅니다. 작은 가위를 사용하여 결합 조직을 잘라 아래에 있는 두개골을 드러냅니다. 그런 다음 두개골과 목의 등쪽 위에 있는 근육을 제거합니다.
3. 먼저 큰 집게로 두개골의 앞쪽을 고정하여 두개골에서 뇌를 제거한 다음 작은 가위를 사용하여 구멍의 양쪽 뼈를 두 개의 옆으로 절개합니다(그림 1, A1 및 A2로 표시된 절단).
   1. 눈 사이(브레그마 바로 앞쪽)를 한 번 더 절개한 다음(그림 1, B로 표시된 절단) 시상 봉합선을 따라 앞쪽으로 조심스럽게 자르고 절단된 두개골 부분을 반사하여 뇌를 드러냅니다(그림 1, C로 표시된 절단).
   2. 작은 주걱을 사용하여 뇌를 퍼서 배양 접시에 놓습니다. 절단해야 할 뇌의 아래쪽 측면에 있는 뇌 신경에 유의하십시오. 이것은 더 작은 크기의 마이크로 주걱을 사용하여 수행할 수 있습니다. 더 큰 주걱을 사용하여 절단 용액 슬러리로 채워진 25ml 비커로 뇌를 옮깁니다.
4. 슬라이싱을 위해 뇌 반구를 준비합니다.
   1. 신선한 배양 접시의 바닥에 6cm 여과지 한 조각을 놓고 신선한 절단 용액, 슬러리 및 거품을 채웁니다. 더 큰 주걱을 사용하여 복부 쪽이 아래를 향하도록 뇌를 여과지 위에 놓습니다. 청소한 새 면도날로 뇌를 잘라 소뇌를 제거한 다음 정중선을 따라 잘라 뇌를 두 개의 반구로 분리합니다.
5. 비브라톰 조직 블록을 준비합니다.
   1. 식힌 비브라톰 조직 블록을 가져다가 표면을 말리고 중간에 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울을 놓고 뇌의 대략적인 크기까지 고르게 펴 바릅니다. 작은 주걱을 사용하여 뇌 반구 중 하나를 큰 마이크로 주걱으로 조작하여 뇌의 내측이 아래로 향하도록 합니다.
   2. 두 번째 여과지의 뇌 계면에 있는 주걱의 가장자리를 만져 가능한 한 많은 용액을 제거합니다. 더 작은 주걱을 사용하여 뇌를 접착제로 안내하여 큰 주걱에서 뇌를 밀어냅니다.
   3. 절단 블록을 비브라톰 챔버에 고정하고 챔버에 절단 용액 슬러리와 거품을 채워 뇌가 완전히 잠기도록 합니다. 뇌의 복부 쪽이 칼날을 향하도록 절단 블록을 회전합니다.
6. 뇌를 자르다.
   메모: 각 비브라톰은 고유하므로 제조업체의 지침을 따르십시오.
   1. 슬라이스 두께를 450μm로 설정하고 블레이드가 약 0.3mm/s의 속도로 뇌를 통과할 때 진동하는지 확인합니다. 복부 쪽에서 피질 표면까지 뇌를 완전히 절단하면 전기 생리학적 기록에 사용할 수 있는 전체 뇌 시상 슬라이스가 생성됩니다. 절편은 측방에서 내측으로 생성되며 일반적으로 각 반구에서 3 - 4 절편을 절단할 수 있습니다.
   2. 슬라이스의 바닥이 들리면 구부러진 27G 바늘을 사용하여 슬라이스를 부드럽게 다시 누릅니다. 각 슬라이스를 절단할 때 전사 피펫을 사용하여 최대 8시간 동안 사용할 수 있는 보관 챔버의 플랫폼으로 이동합니다.

3. 세포외 전기생리학 기록

1. 녹음 챔버에 슬라이스를 장착합니다.
   1. 전사 피펫을 사용하여 1 - 2 ml/min으로 흐르는 aCSF가 관류되고 32 °C로 가열된 수중 기록 챔버에 뇌 절편을 넣습니다. 기록에 사용되는 aCSF는 Mg²⁺ 농도가 2mM에서 4mM로 증가함에 따라 홀딩 챔버의 aCSF와 다릅니다.
   2. "하프"(나일론 가닥이 2-3mm 간격으로 뻗어 있는 반원형 스테인리스 스틸)로 슬라이스를 고정합니다. 가닥이 CA1과 평행이 되도록 하프를 놓습니다. 32°C에서 관류 속도를 8 - 10 ml/min으로 높입니다.
2. 해부 현미경 아래에서 자극 전극과 기록 전극(aCSF 기록 용액으로 채워진 유리 전극)을 CA1의 방사선층 표면에 놓습니다(그림 2A). 자극 전극을 먼저 배치한 다음 기록 전극을 배치합니다.
3. 120 - 150μA 진폭과 0.1msec 지속 시간 테스트 펄스로 Schaffer 담보를 자극하고 결과 fEPSP(Field Excitatory Post Synaptic Potential) 파형을 관찰하여 슬라이스 상태를 확인합니다(그림 2B). 자극 및 기록 전극은 작은 파이버 발리 및 큰 진폭으로 fEPSP 기록을 얻기 위해 슬라이스 표면에서 약 50 - 100 μm 떨어진 슬라이스 내부로 이동해야 할 수 있습니다. Schaffer collateral 유발 fEPSP는 고정관념적이며 슬라이스 건강에 대한 좋은 지표를 제공합니다. 건강한 슬라이스는 일반적으로 0.3 미만의 섬유 발리 대 fEPSP 진폭 비율을 보여줍니다.
4. 전극의 위치를 변경합니다.
   1. 해부 현미경을 사용하여 그림 3A와 같이 자극 전극을 지층 오리엔스의 중앙으로 이동하고 기록 전극을 기록 전극에 가능한 한 가깝게 피라미드 세포층으로 이동합니다. 120 - 150 μA 테스트 펄스에 대한 fEPSP 응답 진폭이 약 1 mV가 되도록 자극 및 기록 전극을 약 50 - 100 μm 슬라이스로 밀어 넣
   어야 할 수 있습니다.
5. γ 진동을 생성합니다.
   1. γ 진동을 생성하려면 200Hz에서 전달되는 20 x 0.1msec 펄스의 열로 조직을 자극합니다. 이 파탄성 자극은 5분마다 전달될 때 재현 가능한 반응을 생성할 수 있습니다.
6. 다음 기록 매개변수를 사용합니다.
   1. 아날로그-디지털 컨버터의 입력 전압 범위와 일치하도록 출력 신호의 게인을 스케일링합니다. 최대 예상 신호 편위가 입력 전압 범위의 최소 30%를 사용하는지 확인하십시오. 게인을 너무 높게 설정할 때는 신호가 잘릴 수 있으므로 주의하십시오. 필드 녹음에 필요한 일반적인 대역폭은 베이스라인 드리프트를 제거하기 위해 0.1Hz에서 AC 커플링이 있는 500Hz입니다.
   2. 신호 앨리어싱을 피하기 위해 저역 통과 필터의 코너 주파수보다 최소 4 - 5배 더 빠르게 디지털화합니다.

결과

그림 1. 두개골과 그 위에 있는 피부의 개략도로, 뇌를 드러내기 위해 베인 상처의 위치를 보여줍니다. A1, A2, B 및 C는 뇌를 제거하기 위해 두개골을 열기 위해 절단해야 하는 절단 위치를 표시합니다.

그림 2. 슬라이스 건강을 테스트하기 위해 CA1 Schaffer 담보에 자극 및 기록 전극을 배치합니다. (A) 자극전극(Stim)과 기록전극(Rec)의 배치를 보여준다. (B) 120μA 자극(*로 표시된 섬유 발리)에 의해 유발되는 fEPSP의 대표적...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4-(N-에틸-N-페닐아미노)-1,2 디메틸-6-(메틸아미노) 피리미디늄 클로라이드(ZD7288)	시그마-알드리치	Z3777
비우쿨린	시그마-알드리치	14340
6-시아노-7-니트로퀴녹사-라인-2,3 디온(CNQX)	시그마-알드리치	C127
니켈	시그마-알드리치	266965
카르바마제핀	시그마-알드리치	C4024
(2R)-아미노-5-포스포노펜타노아테(APV)	토크리스 바이오사이언스	105
레티가빈	켐퍼시픽	150812-12-7
콜린-Cl	시그마-알드리치	C1879-5KG
케이클	시그마-알드리치	P9333-500G
나H2PO4	시그마-알드리치	S9638-250G
나HCO3	시그마-알드리치	S6297-250G
염화나트륨	시그마-알드리치	S7653-5KG
포도당	시그마-알드리치	G8270-1KG
칼슘2.2H2O	시그마-알드리치	223506-500지
마그네슘Cl2.6H2O	시그마-알드리치	M2670-500지
전극 유리	하버드 기구	GC150F-10
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