휘발성 냄새 물질에 대한 반응으로 Drosophila Sensilla의 전기 생리학적 기록

초록

출처: Ng, R., et al. 저휘발성의 냄새 물질에 대한 반응으로 Drosophila Trichoid sensilla의 전기 생리학적 기록. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오에서는 전기생리학 연구를 위해 살아있는 초파리 파리가 튜브에 장착되어 있습니다. 전극은 파리의 후각 수용체 뉴런과 함께 페로몬에 대한 특정 뉴런 반응을 기록하기 위해 감각의 기저부에 위치합니다.

프로토콜

1. at4 레코딩을 위한 하드웨어 준비

1. 피펫 풀러 기기를 사용하여 알루미노실리케이트 유리 모세관(O.D 1.0mm, I.D. 0.64mm)이 있는 전극을 준비합니다. 플라이의 clypeus(즉, 플라이 헤드 앞쪽, 입 부분 위의 둥근 판)에 쉽게 삽입할 수 있도록 한 쌍의 미세한 집게로 기준 전극의 끝을 약간 무디게 합니다.
   참고: 이 연구에는 생후 7일 된 WT(와일드형) 수컷(베를린)이 사용되었습니다. AHL 식염수 용액을 두 전극의 전해질로 사용하십시오.
2. NaCl 6.312g, KCl 0.373g,_NaHCO3 0.337g,_NaH2PO40.1120g, 트레할로스 _ּ2H2O1.892g, 자당 3.423g, HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산) 1.192g과 증류수 900mL를 혼합하여 AHL(성체 혈림프유사) 1L를 준비하고, 및 8.2mL의 1M MgCl₂. 증류수를 사용하여 총 부피를 1L까지 가져오고 1N NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 가져오고 진공 구동 필터 시스템으로 용액을 살균합니다. 장기 보관을 위해 AHL 부분 표본을 4°C로 유지하십시오.
   참고: 팔미톨레산의 일관된 전달은 카트리지 간의 균일성에 달려 있습니다. 각 카트리지는 재현 가능한 방식으로 조립해야 합니다.
3. 면도날을 사용하여 200μL 피펫 팁의 끝에서 0.9cm를 제거하여 4.1cm 크기의 첫 번째 카트리지 섹션을 만듭니다. 그림 1A에 자세히 설명된 치수를 참조하십시오. 다른 200μL 피펫 팁을 사용하고 팁과 베이스에서 1.7cm 및 1.5cm를 제거하여 두 번째 카트리지 섹션을 만듭니다. 1.8cm 측정(그림 1A). 재현성을 보장하기 위해 눈금자를 사용합니다.
4. 1/8" 구멍 펀처를 사용하여 여과지에서 디스크를 자릅니다.
5. 집게를 사용하여 두 번째 카트리지 섹션의 끝 부분에 여과지 디스크를 놓습니다. 공기가 통과할 수 있는 카트리지 팁의 구멍을 육안으로 확인하십시오.
6. 그림 1A와 같이 첫 번째 및 두 번째 카트리지 섹션을 부착합니다. 두 번째 카트리지 섹션을 아래쪽으로 기울여 준비물을 정사각형으로 조준할 수 있도록 합니다(그림 1B).
7. 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 냄새 전달 튜브와 카트리지를 연결합니다.
   참고: 이 설계를 사용하면 카트리지를 바깥쪽으로 회전하여 쉽게 교체할 수 있습니다(그림 1C).
8. 한 질량 컨트롤러에서는 일정한 가습 공기 흐름을 2L/분으로 설정하고 다른 질량 컨트롤러에서는 냄새 흐름 흐름을 500mL/분으로 설정합니다.
9. 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 500ms 냄새 퍼프를 관리하는 절차를 프로그래밍합니다.

2. 배송을 위한 팔미톨레산 취취제 용액의 준비

참고: OR47b ORN은 시스팔미톨레산과 트랜스팔미톨레산에 모두 반응합니다. 팔미톨레산은 상온에서 불안정하기 때문에 재고는 -20°C에서 보관하고 개봉 후 한 달 이내에 사용합니다. 에탄올은 팔미톨레산에 대해 선택되는 용매입니다.

1. 와류 믹서를 사용하여 10μL의 시스 또는 트랜스 팔미톨레산 스톡 또는 희석액을 90μL의 100% 에탄올과 완전히 혼합하여 1.7mL 마이크로튜브에서 10배 연속 희석합니다. 실험 전에 매일 신선한 팔미톨레산 희석액을 준비하고 하루 이내에 사용하십시오.
   참고: 에탄올에 용해되지 않는 냄새 물질은 다른 유형의 유기 용매로 냄새 희석액을 준비하기 위해 유리 바이알을 사용하는 것이 좋습니다.
2. P10 마이크로피펫을 사용하여 원하는 희석액의 시스-팔미톨레산 용액 5μL를 각 카트리지의 여과지에 도포합니다.
   참고: 최고 용량(^10-1)에는 450μg의 화합물이 포함되어 있습니다. 트랜스 팔미톨레산 용액의 경우 대신 4.5μL를 적용하여 최고 용량(^10-1)에 화합물 450μg이 포함되도록 합니다.
3. 팔미톨레산 카트리지를 실온 및 7.59mmHg의 압력에서 1시간 동안 진공 건조기에 넣어 용매를 완전히 증발시킵니다.
   알림: 카트리지는 RT에서 최대 4시간 동안 사용할 수 있습니다.

3. 생체 내 전기생리학적 기록을 위한 at4 Sensilla에 대한 즉각적인 접근을 위한 초파리의 준비

참고: WT 파리(베를린)는 25°C의 표준 옥수수 가루 배지에서 12:12 명암 주기로 사육됩니다. eclosion에, 파리는 성별에 따라 10 개의 그룹으로 분리되어 7 d의 나이까지 그룹 하우스됩니다. 수컷과 암컷 파리의 Or47b ORN(후각 수용체 뉴런)은 팔미톨레산에 반응합니다. 단순화를 위해 현재 연구에서는 수컷 파리만 조사했습니다.

1. 플라이 프렙 슬라이드 조립: 유리 슬라이드에 유리 커버슬립(18 x 18mm2)을 소량의 모델링 점토 위에 놓고 유리 슬라이드와 ~3° 각도를 형성합니다. 커버슬립의 안쪽 가장자리와 바로 아래 슬라이드 영역에 양면 테이프를 붙입니다. 매일 녹음할 때마다 새 테이프로 교체하십시오(그림 2A).
2. 플라이 흡입기15를 사용하여 튜빙에서 관심 플라이를 수집한 다음 튜빙 끝에 200μL 피펫 팁을 끼웁니다. 동시에 튜브에 공기를 불어넣으면서 튜브를 앞으로 튕겨 파리를 파이펫 팁 끝으로 밀어 넣습니다. 면도날을 사용하여 파리의 몸통 바로 아래를 자르고 파리보다 머리 위 2개 길이를 자릅니다.
3. 피펫 팁의 바닥을 모델링 점토로 밟고 더듬이와 클리피우스가 모두 노출될 때까지 파리를 위로 밉니다(그림 2B). 파리를 죽이지 않으려면 더듬이와 아리스타가 노출될 만큼의 점토만 추가하면 파리의 복부가 으스러지는 것을 방지할 수 있습니다. 또한 점토를 천천히 부드럽게 첨가하여 갑작스러운 수축을 방지하십시오. 더듬이나 주둥이의 움직임을 확인하여 파리가 살아 있는지 확인합니다.
4. 집게를 사용하여 파리가 들어 있는 피펫 팁을 움직입니다. clypeus가 관찰자의 오른쪽을 향하도록 머리의 방향을 지정합니다. 안테나의 측면이 테이프로 감긴 커버슬립 표면에 닿을 때까지 미세한 집게를 사용하여 커버슬립을 따라 프렙을 조정합니다(그림 2B).
5. 움직임을 방지하기 위해 안테나를 양면 테이프에 고정하기 위해 arista에 고정 막대를 놓습니다(그림 2B).
   알림: 홀딩 로드는 피펫 풀러가 있는 붕규산 유리 모세관에서 당겨지고 모델링 점토로 제자리에 고정됩니다(그림 2A).
6. 리그의 스테이지에 프렙을 놓습니다(그림 2C). 현미경을 사용하여 안테나의 세 번째 세그먼트의 원위-측면 가장자리를 따라 트리코이드가 보이는지 확인합니다.
   참고: 센실라(sensilla)는 배경에 윤곽을 그려야 식별을 단순화하고 녹음을 용이하게 해야 합니다(그림 3). 이 제제에서 가장 접근하기 쉬운 트리코이드 센실라는 at4 유형입니다.
7. 앞서 설명한 바와 같이, 2, 15는 분취제에서 약 2cm 떨어진 별도의 공기 전달 튜브를 통해 전달되는 일정한 가습 공기 흐름(2L/분) 하에서 분반을 유지합니다(그림 4).

4. 팔미톨레산에 대한 반응으로 at4 트리코이드에서 or47b ORN의 at4 Sensillum 활성 기록

1. 기준 전극을 clypeus에 삽입합니다(그림 3A). 빠르고 부드러운 동작으로 전극이 표면 바로 아래에 삽입되어 조직 손상을 방지하기 위해 큐티클 아래의 혈림프와 접촉할 수 있는지 확인합니다.
2. 목표 센실럼과 동일한 시야 평면에 들어갈 때까지 기록 전극을 천천히 내립니다(그림 3B). 50X 대물 렌즈로 녹화합니다.
   메모: 질긴 트리코이드 큐티클은 기록 전극을 sensillar base에 삽입해야 하며, 더 넓은 영역은 전극이 편향될 가능성을 줄이는 더 큰 표적을 제공합니다(그림 3B, 삽입 사진).
3. 냄새 자극을 sensillum에 적용하기 전에 다음 선택 기준을 준수하십시오 : 이러한 표준을 충족하지 못하는 trichoid는 거부해야하며 대신 다른 sensillum을 선택해야합니다.
   1. 높은 신호 대 잡음비를 관찰하십시오(예는 그림 3C 참조).
   2. at4A 및 at4C 뉴런에서 식별 가능한 스파이크를 관찰합니다(그림 3C).
      알림: at4B 스파이크 진폭은 at4A10과 매우 유사하게 나타나며 냄새 자극 없이는 쉽게 식별할 수 없습니다.
   3. at4A 뉴런의 기저 발화 속도가 20Hz 안팎에서 20Hz.
      이하인지 관찰합니다. 참고: 이 기준은 뉴런의 기저 발화 속도가 기저 ORN의 발화 속도보다 높기 때문에 at4A에 특정됩니다. 훨씬 더 높은 기저 발화는 전극 삽입 중에 뉴런이 손상되었을 수 있음을 나타냅니다.
4. 카트리지를 냄새 전달 튜브에 연결합니다. 용매 제어부터 시작하여 저농도에서 고농도까지 냄새 물질에 대해 설명하십시오. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 카트리지를 프렙 쪽으로 조종하면서 카트리지를 프렙 헤드에 직각으로 조준합니다. 카트리지가 몇 밀리미터 떨어진 안테나(그림 4)를 직접 가리키고 있는지 육안으로 확인합니다.
   알림: 목표는 카트리지의 개구부를 안테나에서 직접 향하게 하고 대상 조직 근처에 배치하는 것입니다.
5. 냄새 카트리지가 오른쪽의 기록 전극에서 1 - 2 mm, 아래의 플라이 프렙 슬라이드에서 약 1 mm 떨어져 있는지 확인합니다.
   메모: 여기에 설명된 설정에서 냄새 유발 카트리지는 기록 전극, 기준 전극 및 플라이 프렙 슬라이드(그림 4)로 밀접하게 둘러싸여 있습니다(그림 4).
   참고: 카트리지와 기록/참조 전극 사이의 거리를 고려하십시오. 약 4mm의 거리를 권장합니다. 의도하지 않은 접촉은 신호를 종료하고 기록 전극의 끝을 끊어 현재 뉴런을 손상시키고 추가 기록을 복잡하게 만들 수 있습니다.
   참고: 카트리지와 플라이 준비 슬라이드 사이의 거리를 고려하십시오. 커버슬립을 만지면 녹음 전극이 분리되어 녹음이 중단될 수도 있습니다.
6. 데이터 수집 소프트웨어에서 "기록"을 눌러 기록을 시작합니다.
   참고: 각 10초 녹음에 대해 500단계에서 설명한 대로 단일 1.9ms 냄새 펄스가 안테나에 직접 전달됩니다.
7. 냄새 물질을 도포한 후 다음으로 농도가 높은 카트리지로 교체하기 전에 카트리지를 조심스럽게 집어넣으십시오. 전체 투여량 범위가 얻어질 때까지 계속하십시오.
   참고: 가능한 적응 효과를 피하기 위해 각 플라이에서 하나의 Or47b ORN만 기록하는 것이 좋습니다.
8. 그날의 녹음을 마친 후 녹음 전극을 증류수로 철저히 헹굽니다.
9. 상용 오프라인 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 플롯합니다.

결과

그림 1: 카트리지 및 후각계 설정. (A) 냄새 카트리지의 준비. 왼쪽에서 오른쪽으로: 표준 200μL 피펫 팁, 첫 번째 및 두 번째 카트리지 섹션, 완성된 오취제 카트리지. (B) 후각계에 연결된 카트리지로 두 번째 섹션의 하향 각도를 보여줍니다. (C) 부착 된 냄새 카트리지와 함께 마이크로 매니퓰레이터에 장착 된 냄새 전달 튜브를 묘사 한 후각계 설정.

그림 2: 초파리 제제. (A) 플라이, 커버슬립 및 홀딩 로드의 상대적 위치를 보여주는 완전한 준비물. (B) 파리의 위치, 더듬이 방향 및 c...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
준비 설정 및 기타 재료
피펫 풀러 기기	셔터 기기, 미국 Novato CA	P97	피펫 풀러
붕규산 유리 모세 혈관	World Precision Instruments, 미국 플로리다주 새러소타	AN-번호 1B100F-4	홀딩 로드를 만들기 위해
알루미노실리케이트 유리 모세혈관	Sutter Instruments, 미국 캘리포니아 노바토	AF100-64-10	전극을 만들기 위해
Superfrost 현미경 슬라이드	Fisher Scientific, 미국 펜실베이니아주 피츠버그	전화: 12-550-143	플라이 프렙 스테이션용
영구 양면 테이프	스카치 세인트폴, 미네소타, 미국	해당 없음	플라이 프렙 스테이션용
정립 현미경	Olympus, 신주쿠, 도쿄, 일본	BX51	레코딩 리그용
Plastalina 모델링 클레이	Van Aken, 노스 찰스턴, 사우스 캐롤라이나 주, 미국	B0019QZMQQ	준비 스테이션 및 고정 로드를 안정화하기 위해
SFCA 멤브레인이 있는 급류 멸균 일회용 필터 장치, 0.45mm	Nalgene, 미국 뉴욕 로체스터	#의 156-4045	AHL 용액을 살균하기 위해
200 μL 피펫 팁	VWR 래드너, 펜실베니아 미국	53508-810	냄새 카트리지 및 플라이 준비를 위해
여과지	Whatman, 메이드스톤 켄트 영국	740-E	냄새 카트리지를 만들려면
진공 데시케이터	Cole-Parmer, 미국 일리노이주 버논 힐스	VX-06514-30	에탄올 용매를 기화시키기 위하여
시스-팔미톨레산	Cayman Chemical, 미국 미시간주 앤아버	#10009871 (CAS # 373-49-9)	OR47B 부취제
트랜스 팔미톨레산	Cayman Chemical, 미국 미시간주 앤아버	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	OR47B 부취제
에탄올	Spectrum Chemical, MFG., 미국 뉴브런즈윅, 뉴저지	E1028-500MLGL	팔미톨레산을 희석하기 위해
부취제 카트리지 Micromanipulator	Siskiyou, 그랜트 패스 또는 미국	MX130R	후각계를 배치하려면
Flow Vision 소프트웨어	알리캇, 투스콘, 애리조나, 미국	플로우비전SC	유량을 제어하는 소프트웨어
질량 컨트롤러	알리캇, 투스콘, 애리조나, 미국	MC-2SLPM-디	가습 공기의 유량을 제어하기 위해
질량 컨트롤러	알리캇, 투스콘, 애리조나, 미국	MC-500SCCM-디	냄새 자극을 위한 유량을 제어하기 위해
클램프펙스	Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일	버전 10.4	데이터 수집 소프트웨어
공기 전달 튜브	Ace Glass, Vineland NJ 미국	8802-936	가습 공기를 전달하기 위해
50X 대물 렌즈	Olympus, 신주쿠, 도쿄, 일본	LMPLFL50X	레코딩 리그
클램프핏 10	Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일	버전 10.4	스파이크 분석용 소프트웨어
이고르 프로 6	WaveMetrics, 레이크 오스웨고 또는 미국	버전 6.37	데이터 분석용 소프트웨어
오디오 모니터	ALA Scientific Instruments, 미국 뉴욕 파밍데일	NPIEXB-오디스-08B	개별 스파이크를 청각적으로 보고합니다
세포외 증폭기	ALA Scientific Instruments, 미국 뉴욕 파밍데일	엔피ext-02F	전기 신호의 진폭을 증가시키기 위해
밸브 컨트롤러	워너 인스트루먼트	VC-8	냄새 자극을 위한 밸브의 개방을 제어하기 위해
기록 전극 Micromanipulator	Sutter Instruments, 미국 캘리포니아 노바토	MP-285	기록 전극을 배치하려면
헤드 스테이지 앰프	ALA Scientific Instruments, 미국 뉴욕 파밍데일	이그-16.0008	전기 신호의 진폭을 증가시키기 위해
오실로스코프	Tektronix, Beaverton OR 미국	TDS2000C	개별 스파이크에 대한 시각적 보고서

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