방법 논문

쥐 해마 절편에서 CA3-CA1 시냅스 반응 기록

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Shetty, M. S. et al., 설치류의 급성 해마를 사용한 시냅스 태깅/캡처 및 교차 캡처 조사.J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 쥐 해마 절편에서 CA3-CA1 시냅스 반응을 기록하는 방법을 보여줍니다. 해마 절편에 자극 및 기록 전극을 배치하고 시냅스 반응 강도를 평가하기 위해 fEPSP(field excitatory postsynaptic potential)를 측정하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. CA3-CA1 시냅스 반응 기록

참고: 전계 전위 기록에 사용되는 전기생리학 설정은 그림 1A에 나와 있습니다. 전기 설정의 적절한 접지 후 전기 간섭이 통제할 수 없는 경우 패러데이 케이지를 강력히 권장합니다. 다양한 유형의 수중 및 계면 챔버가 상업적으로 이용 가능합니다. 그러나 계면 챔버는 슬라이스가 더 강력한 시냅스 반응을 나타내기 때문에 선호됩니다.

  1. 전극의 위치 지정
    1. 전기 장치(자극기 및 증폭기)를 켭니다. 미세 조작기의 플렉시글라스 홀더에 자극 및 기록 전극을 장착하고 고정합니다.
      메모: 우리는 자극 및 기록 목적으로 5MΩ 저항의 래커 코팅된 스테인리스강 전극을 사용합니다.
    2. 사용하기 전에 이 전극을 인발된 유리 모세관 내부에 삽입하고 에폭시 접착제로 고정하여 전극 팁의 작은 부분만 노출시킵니다(그림 1E). 이것은 그렇지 않으면 가느다란 전극에 힘을 주고 전극 홀더에 단단히 고정하는 데 도움이 됩니다.
    3. 현미경으로 안내되어 자극 전극을 CA1 영역의 방사선층에 배치하여 Schaffer 측부 섬유를 자극하고 CA1의 정점 수지상 영역에 있는 기록 전극을 자극하여 field-EPSP(fEPSP) 반응을 기록합니다.
      메모: 전극을 사용하여 슬라이스 위의 액체 표면에 접근하면 슬라이스 표면을 빠르게 찾는 데 도움이 되는 소리가 납니다(단, ampliifier는 확성기에 연결되어 있습니다).
    4. 시냅스 태깅 및 캡처 실험에서는 실험의 필요에 따라 기록 전극의 양쪽에 2개 또는 3개의 자극 전극(S1, S2 또는 S3)을 배치하여 둘 이상의 독립적이지만 중복되는 입력을 자극합니다. 자극 전극과 기록 전극을 약 200μm 간격으로 배치합니다.
    5. 필요한 경우, 개체군 급증을 기록하기 위해 피라미드층에서 다른 기록 전극을 찾습니다(그림 2A). 두 전극이 슬라이스에 닿았을 때 획득 소프트웨어를 사용하여 적절한 fEPSP 신호를 보장하기 위해 테스트 자극을 제공합니다.
      메모: 테스트 자극을 위해 이위상, 정전류 펄스(임펄스 지속 시간 0.1msec/반파)를 사용합니다.
    6. 적절한 fEPSP 신호가 얻어지면 매니퓰레이터의 미세한 움직임 손잡이를 사용하여 전극을 약 200μm 깊이로 조심스럽게 내립니다. 조각이 복구될 때까지 20분 정도 기다립니다.
  2. 입력-출력 관계
    1. 전류 강도 범위에서 기울기 값을 측정하여 각 입력에 대한 입력-출력 관계(구심성 자극 대 fEPSP 기울기)를 결정합니다. 20μA에서 100μA 사이에서 이 작업을 수행합니다. 그런 다음 최대 fEPSP 기울기의 40%를 얻기 위해 각 입력에 대한 자극 강도를 설정합니다. 실험 내내 이 값을 일정하게 유지합니다.
    2. 15-20분 후 기준선 기록을 시작합니다. 이 기간 동안 fEPSP 기울기를 면밀히 모니터링하고 기울기가 설정 값에서 10% 이상 변동하는 경우 자극 강도를 재설정하고 새 기준선을 시작합니다. 진행하기 전에 최소 30분 또는 1시간의 안정적인 기준선을 기록합니다.
      메모: 테스트 또는 베이스라인 자극을 위해 5분마다 0.2Hz 바이페이즈, 정전류 펄스(극성당 0.1msec)의 4개 스윕을 사용합니다. 그런 다음 이러한 4개 응답의 평균 기울기를 하나의 반복으로 간주합니다. 신호는 차동 증폭기에 의해 필터링 및 증폭되고, 아날로그-디지털 변환기를 사용하여 디지털화되고, 맞춤형 소프트웨어를 통해 온라인으로 모니터링됩니다.

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결과

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그림 1.(A) 자극기, (b) 차동 증폭기, (c) 아날로그-디지털 컨버터, (d), 오실로스코프, (e), 수집 소프트웨어가 있는 컴퓨터, (f), 진동 방지 탁상형(g), >4배 배율의 현미경, (h), 인터페이스 뇌 슬라이스 챔버, (i), ACSF 및 탄화물 공급을 위한 관류 시스템, (j), 온도 조절기(k), 조명 소스(l), 전극 홀더가 있는 매니퓰레이터로 구성된 전위 기록을 위한 전기생리학 설정. (B) 계면 뇌 절편 챔버. (C) & (D) 계면 챔버의 해마 절편. (E) 유리 모세관에 밀봉된 스테인리스 스틸 전극.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
I. ACSF 구성 요소 화학 물질
1. 염화나트륨 (NaCl)시그마-알드리치S5886
2. 염화칼륨 (KCl)시그마-알드리치P9541
3. 마그네슘 황산염 헵타하이드레이트 (MgSO4.7H20)시그마-알드리치M1880
4. 염화칼슘 이수화물(CaCl2.2H2O)시그마-알드리치C3881
5. 인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)시그마-알드리치P9791
6. 중탄산 나트륨 (NaHCO3)시그마-알드리치S5761
7. 무수 D-글루코스 (C6H12O6)시그마-알드리치G7021
II. 전기생리학 기기
1. 현미경올림푸스, 일본모델 SZ61
2. 온도 조절기Scientific Systems Design Inc., 캐나다PTC03
3. 차동 AC 증폭기AM Systems, 미국모델 1700
4. 고립된 맥박 자극기AM Systems, 미국모델 2100
5. 오실로스코프Rhode & SchwarzHM0722
6. 디지털-아날로그 컨버터Cambridge Electronic Design Ltd. 영국 케임브리지CED-파워 1401-3
7. 인터페이스 브레인 슬라이스 챔버Scientific Systems Design Inc., 캐나다BSC01
8. 튜빙 펌프Ismatec, Idex Health & Science, 독일REGLO-아날로그
9. Carbogen 유량계콜-파머제03220-44
10. 파이버 라이트 일루미네이터돌란-제너 인더스트리파이버 라이트 MI-150
11. 마이크로 매니퓰레이터Marzhauser Wetzlar, 독일00-42-101-0000 (MM-33)
00-42-102-0000 (MM-32)
12. 전극AM Systems, 미국571000 (스테인레스 스틸, 0.010, 5MΩ, 8도)
(영문) (영문) 호

재인쇄 및 허가

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허가 요청

태그

EPSPSchaffer

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