Drosophila의 감각 뉴런에서 생리적 반응 감지

1. 샘플 준비

1. Gal4 드라이버 라인을 UAS-GCaMP5G 초파리 멜라노가스터 파리(w; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40)을 참조하십시오. 십자가가 25 ° C에서 자라도록하십시오 .
   메모: Gal4 또는 UAS-GCaMP 전이유전자의 여러 사본으로 파리를 생성하면 형광 신호 강도를 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다. UAS-GCaMP 전이유전자(UAS-GCaMP3)의 이전 버전은 Gr68a-Gal4 드라이버의 제어 하에 발현될 때 매우 약한 형광 강도를 보였습니다.
   1. 새로 폐쇄된 성충 파리를 수집하고 성별로 분리하여 25°C에서 기릅니다.
      참고: GCaMP5G 형광의 기준선 수준은 14일에서 28일 사이의 파리에서 최적입니다. 파리를 성별로 분리하는 것은 신경 반응에 영향을 미칠 수 있는 사회적 상호 작용의 가능성을 배제합니다.
2. CO₂의 온화한 흐름에서 파리를 마취합니다.
3. 먼저 0.17mm 커버슬립 중앙에 매니큐어 한 방울을 떨어뜨려 유리 커버슬립에 플라이를 부착합니다. 투명한 매니큐어 한 방울 위에 파리를 옆으로 부드럽게 놓고 파리가 한 방울 전체를 덮도록 합니다.
4. 8X 배율에서 사용되는 해부 실체현미경으로 1.5단계와 1.6단계를 수행합니다.
5. 젖은 붓을 사용하여 파리의 앞다리를 뻗습니다. 첫 번째 및 다섯 번째 족근 분절에 두 개의 얇은 테이프 스트립을 배치하여 앞다리를 제자리에 고정합니다(그림 1A). 이렇게 하면 이미징을 위해 족근 분절 T2-T4가 노출됩니다(그림 1B).
6. 주둥이의 뉴런을 이미지화하려면 주둥이의 연단에 얇은 테이프 스트립을 놓아 labellum을 노출시킵니다(그림 1C, D).
7. PAP(Peroxidase-antiperoxidase) 펜으로 플라이 주위에 소수성 장벽을 그려 용액이 커버슬립 표면 위로 흐르는 것을 방지합니다. 장착 후 30분 이내에 측정하십시오.

2. 자극 솔루션의 준비

1. PBST (Triton X-100을 사용한 인산염 완충 식염수) 용액에 묽은 친유성 리간드 (예 : CH₅0₃)를 : 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 0.1 % Triton X-100 (v / v);pH 7.4.
   1. PBST를 사용하여 리간드의 1mg/ml 원액을 만듭니다. PBST.
      를 사용하여 원액의 모든 후속 희석을 준비합니다. 메모: 관심 리간드의 용해도에 따라 이를 용해하기 위해 다른 용매가 필요할 수 있습니다. 표 1은 다양한 용매에서 CH5,0,3의 용해도를 설명한다. 다른 용매와 달리 PBST는 형광을 증가시키지 않았습니다.

3. 미각 뉴런의 자극과 이미지 획득

1. 10 μl 피펫터를 사용하여 10 μl의 PBST를 족근 분절에 놓습니다.
   메모: 이 단계는 다리를 촉촉하게 하고 족근 분절이 떠다니는 것을 방지합니다.
2. 높은 시간 해상도에서 우수한 형광 신호를 얻을 수 있는 충분한 속도와 감도의 카메라가 있는 광학 시스템을 사용하십시오.
   메모: 이 연구를 위해 회전 디스크 컨포칼 현미경과 sCMOS 카메라를 사용했습니다(재료 목록 참조).
3. 이미징할 특정 족골 분절과 뉴런을 선택합니다. 3개의 사전 자극 공초점 Z-스택을 획득합니다.
   1. 이상적으로는 전체 세포 부피를 캡처하면서 최대 시간 해상도를 허용할 수 있을 만큼 충분히 빠른 획득 설정을 사용하는 것이 좋습니다. 획득 설정의 예: 200 msec 노출, 2 x 2 및 6 x 0.5 μm2 광학 섹션 비닝, 2초마다 캡처.
      참고: 고정된 다리는 GCaMP 신호의 눈에 띄는 표백 없이 30초 간격으로 최대 10분 동안 성공적으로 이미지화되었습니다. 더 긴 녹음 시간을 위해 다리가 커버 슬립의 제자리에 매우 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
   2. 전체 이미징 영역에서 최소한의 광표백으로 달성할 수 있는 최고의 신호 대 잡음비를 위해 레이저 출력을 최적화합니다. 여기에 설명된 실험의 경우 30% 투과율에서 491nm 다이오드 레이저(100mW)를 사용하여 다리와 주둥이의 Gr68a 및 ppk23 미각 뉴런을 모두 이미지화합니다. 2 x 2 비닝을 사용하면 노출 시간을 단축하면서 충분한 공간 해상도를 얻을 수 있습니다.
      메모: 레이저 출력 설정은 1.2배에서 4.5배 증가 범위의 형광 변화를 감지하도록 최적화되었습니다.
4. 자극 용액 10 μl를 족근 분절에 피펫팅합니다. 대조군 실험을 위해 10μl의 PBST를 더 추가합니다. 117개의 자극 후 이미지를 즉시 획득합니다.
   메모: 획득한 자극 후 이미지의 수는 형광의 최대 변화(약 2분)에 도달하는 데 걸린 시간을 기반으로 합니다.
   1. 중요한 단계: 준비물에 용액을 피펫팅할 때 앞다리가 제자리에서 벗어날 수 있으므로 피펫 팁으로 플라이를 건드리지 마십시오.
      메모: 또는 micromanipulator를 사용하여 자극이 포함된 유리 모세관을 이미징할 족근 세그먼트 가까이에 정확하게 배치합니다. 제조업체의 지침에 따라 세포 내 미세주입 디스펜서를 사용하여 제어된 양의 자극을 전달합니다.

그림 1: 앞다리 또는 뉴런의 이미징을 위한 살아있는 플라이 장착. (A) 앞다리 장착: 살아있는 수컷 파리의 3.2X 이미지로, 테이프로 커버슬립에 고정된 앞다리를 보여줍니다. (B) 파리의 40X 이미지는 각각의 족근 분절(T1-5)과 제1 족근 분절 위와 다섯 번째 족근 분절에 테이프가 배치된 것을 보여줍니다. (C) 장착: 끝을 노출시키기 위해 연단 위에 테이프 조각을 놓습니다. (D) 자극 추가를 위한 피펫 팁은 플라이보다 약간 위에 있으며 제제와 직접 접촉하지 않습니다.

표 1: 다양한 용매에서 CH503의 용해도. DMSO: 디메틸 설폭사이드. 에탄올, 헥산 및 DMSO 용액을 dH2O(v/v)로 희석했습니다. 0.2% DMSO에서 CH503의 용해도는 250ng/ml로 제한되었습니다. 용매 단독으로 ΔF/F의 증가는 페로몬으로 자극할 때 관찰된 것과 동일했습니다.