Drosophila의 감각 뉴런에서 생리적 반응 감지

초록

출처: Shankar, S., et al. 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 대한 초파리 감각 뉴런의 생리적 반응을 측정합니다. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 리간드 결합 및 형광 이미징을 사용하여 초파리에서 감각 뉴런 반응을 감지하는 방법을 보여줍니다. 리간드는 뉴런 수용체에 결합하여 칼슘 유입을 일으킵니다. 칼슘은 지표 복합체에 결합하여 형광 방출을 유발하여 리간드에 대한 신경 반응을 확인합니다.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. Gal4 드라이버 라인을 UAS-GCaMP5G 초파리 멜라노가스터 파리(w; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40)을 참조하십시오. 십자가가 25 ° C에서 자라도록하십시오 .
   메모: Gal4 또는 UAS-GCaMP 전이유전자의 여러 사본으로 파리를 생성하면 형광 신호 강도를 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다. UAS-GCaMP 전이유전자(UAS-GCaMP3)의 이전 버전은 Gr68a-Gal4 드라이버의 제어 하에 발현될 때 매우 약한 형광 강도를 보였습니다.
   1. 새로 폐쇄된 성충 파리를 수집하고 성별로 분리하여 25°C에서 기릅니다.
      참고: GCaMP5G 형광의 기준선 수준은 14일에서 28일 사이의 파리에서 최적입니다. 파리를 성별로 분리하는 것은 신경 반응에 영향을 미칠 수 있는 사회적 상호 작용의 가능성을 배제합니다.
2. CO₂의 온화한 흐름에서 파리를 마취합니다.
3. 먼저 0.17mm 커버슬립 중앙에 매니큐어 한 방울을 떨어뜨려 유리 커버슬립에 플라이를 부착합니다. 투명한 매니큐어 한 방울 위에 파리를 옆으로 부드럽게 놓고 파리가 한 방울 전체를 덮도록 합니다.
4. 8X 배율에서 사용되는 해부 실체현미경으로 1.5단계와 1.6단계를 수행합니다.
5. 젖은 붓을 사용하여 파리의 앞다리를 뻗습니다. 첫 번째 및 다섯 번째 족근 분절에 두 개의 얇은 테이프 스트립을 배치하여 앞다리를 제자리에 고정합니다(그림 1A). 이렇게 하면 이미징을 위해 족근 분절 T2-T4가 노출됩니다(그림 1B).
6. 주둥이의 뉴런을 이미지화하려면 주둥이의 연단에 얇은 테이프 스트립을 놓아 labellum을 노출시킵니다(그림 1C, D).
7. PAP(Peroxidase-antiperoxidase) 펜으로 플라이 주위에 소수성 장벽을 그려 용액이 커버슬립 표면 위로 흐르는 것을 방지합니다. 장착 후 30분 이내에 측정하십시오.

2. 자극 솔루션의 준비

1. PBST (Triton X-100을 사용한 인산염 완충 식염수) 용액에 묽은 친유성 리간드 (예 : CH₅0₃)를 : 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 0.1 % Triton X-100 (v / v);pH 7.4.
   1. PBST를 사용하여 리간드의 1mg/ml 원액을 만듭니다. PBST.
      를 사용하여 원액의 모든 후속 희석을 준비합니다. 메모: 관심 리간드의 용해도에 따라 이를 용해하기 위해 다른 용매가 필요할 수 있습니다. 표 1은 다양한 용매에서 CH5,0,3의 용해도를 설명한다. 다른 용매와 달리 PBST는 형광을 증가시키지 않았습니다.

3. 미각 뉴런의 자극과 이미지 획득

1. 10 μl 피펫터를 사용하여 10 μl의 PBST를 족근 분절에 놓습니다.
   메모: 이 단계는 다리를 촉촉하게 하고 족근 분절이 떠다니는 것을 방지합니다.
2. 높은 시간 해상도에서 우수한 형광 신호를 얻을 수 있는 충분한 속도와 감도의 카메라가 있는 광학 시스템을 사용하십시오.
   메모: 이 연구를 위해 회전 디스크 컨포칼 현미경과 sCMOS 카메라를 사용했습니다(재료 목록 참조).
3. 이미징할 특정 족골 분절과 뉴런을 선택합니다. 3개의 사전 자극 공초점 Z-스택을 획득합니다.
   1. 이상적으로는 전체 세포 부피를 캡처하면서 최대 시간 해상도를 허용할 수 있을 만큼 충분히 빠른 획득 설정을 사용하는 것이 좋습니다. 획득 설정의 예: 200 msec 노출, 2 x 2 및 6 x 0.5 μm2 광학 섹션 비닝, 2초마다 캡처.
      참고: 고정된 다리는 GCaMP 신호의 눈에 띄는 표백 없이 30초 간격으로 최대 10분 동안 성공적으로 이미지화되었습니다. 더 긴 녹음 시간을 위해 다리가 커버 슬립의 제자리에 매우 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
   2. 전체 이미징 영역에서 최소한의 광표백으로 달성할 수 있는 최고의 신호 대 잡음비를 위해 레이저 출력을 최적화합니다. 여기에 설명된 실험의 경우 30% 투과율에서 491nm 다이오드 레이저(100mW)를 사용하여 다리와 주둥이의 Gr68a 및 ppk23 미각 뉴런을 모두 이미지화합니다. 2 x 2 비닝을 사용하면 노출 시간을 단축하면서 충분한 공간 해상도를 얻을 수 있습니다.
      메모: 레이저 출력 설정은 1.2배에서 4.5배 증가 범위의 형광 변화를 감지하도록 최적화되었습니다.
4. 자극 용액 10 μl를 족근 분절에 피펫팅합니다. 대조군 실험을 위해 10μl의 PBST를 더 추가합니다. 117개의 자극 후 이미지를 즉시 획득합니다.
   메모: 획득한 자극 후 이미지의 수는 형광의 최대 변화(약 2분)에 도달하는 데 걸린 시간을 기반으로 합니다.
   1. 중요한 단계: 준비물에 용액을 피펫팅할 때 앞다리가 제자리에서 벗어날 수 있으므로 피펫 팁으로 플라이를 건드리지 마십시오.
      메모: 또는 micromanipulator를 사용하여 자극이 포함된 유리 모세관을 이미징할 족근 세그먼트 가까이에 정확하게 배치합니다. 제조업체의 지침에 따라 세포 내 미세주입 디스펜서를 사용하여 제어된 양의 자극을 전달합니다.

결과

그림 1: 앞다리 또는 뉴런의 이미징을 위한 살아있는 플라이 장착. (A) 앞다리 장착: 살아있는 수컷 파리의 3.2X 이미지로, 테이프로 커버슬립에 고정된 앞다리를 보여줍니다. (B) 파리의 40X 이미지는 각각의 족근 분절(T1-5)과 제1 족근 분절 위와 다섯 번째 족근 분절에 테이프가 배치된 것을 보여줍니다. (C) 장착: 끝을 노출시키기 위해 연단 위에 테이프 조각을 놓습니다. (D) 자극 추가를 위한 피펫 팁은 플라이보다 약간 위에 있으며 제제와 직접 접촉하지 않습니다.

표 1: 다양한 용매에서 CH₅0₃의 용해도. DMSO: 디메틸 설폭사이드. 에탄올, 헥산 및 DMSO 용액을 dH2O(v...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Gr68A-갈4			H. Amrein(미국 텍사스 A&M 건강 과학 센터)과 J. Carlson(미국 코네티컷주 예일 대학교)의 선물
ppk23-갈4			K. Scott의 선물 (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)
UAS-GCaMP5		42037	블루밍턴 초파리 주식 센터
0.17mm 커버슬립(Gold-Seal 커버슬립)	전자 현미경 서비스	63790-10
매니큐어, "Hard as Nails Clear"	샐리 한센
PAP 펜	시그마-알드리치	Z377821
페인트 브러시			끝이 가는 브러시
테이프	스카치 브랜드
트리톤 X-100	시그마-알드리치	13021
에탄올, 실험실 등급	머 크	10094
헥산, HPLC 등급	시그마-알드리치	H303SK-4
디엠소	시그마-알드리치	472301
PBST (영문)			프로토콜 섹션에 설명된 레시피
채널503			Mori et al., 2010에 기술된 합성
sCMOS 카메라(ORCA 플래시 4.0)	하마마쓰	C11578-22U
현미경 (Ti-Eclipse)	니콘	니켈 - E
회전하는 디스크 스캔 헤드	요코가와	CSU-X1-A1

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