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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 수술
참고: 폐쇄 루프 자극을 위한 수술의 정확한 세부 사항은 사용된 기록 프로브의 유형과 대상 뇌 영역에 따라 다릅니다. 그러나 대부분의 경우 일반적인 수술은 다음과 같은 단계로 구성됩니다.
- 쥐가 있는 케이지를 수술실로 가져와 실리콘 프로브 또는 전극 어레이를 이식하여 신경 활동을 기록합니다.
- 설치류를 2-2.5% 이소플루란으로 마취하고 머리를 입체성 프레임에 고정합니다. 가벼운 촉각 자극에 대한 운동 반응을 관찰하여 수술 중 동물이 의식을 잃었는지 확인하십시오.
- 수술 중 건조를 최소화하기 위해 안연고를 바르십시오.
- 수술 부위를 면도하고 2% 클로르헥시딘 용액과 70% 이소프로필 알코올로 피부를 소독합니다.
- 리도카인(5mg/kg)을 전극이 이식될 뇌 부위의 두피 아래에 주사합니다.
- 향후 임플란트가 삽입될 부위의 두피를 절개하고 메스와 면봉을 사용하여 노출된 두개골에서 골막을 제거합니다.
- 임플란트의 구조적 지지체로 앵커 나사(~0.5mm)를 이식하기 위해 두개골에 4-8개의 구멍을 뚫습니다. 나사를 구멍에 삽입하여 두개골에 부착하고 제자리에 단단히 고정되었는지 확인합니다.
- 지정된 좌표에서 개두술을 뚫고 마이크로드라이브/프로브 임플란트를 삽입합니다.
메모: 폐쇄 루프 자극에 대해 설명된 프로토콜은 전극이 삽입되는 모든 뇌 영역에 적용됩니다.
- 마이크로드라이브/프로브 및 필요한 전기 인터페이스 커넥터를 치과용 아크릴을 사용하여 두개골에 고정합니다. 치과용 아크릴의 양은 임플란트를 단단히 부착할 수 있을 만큼 충분해야 하지만 주변 연조직과 접촉하지 않아야 합니다.
- 수술 후에는 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 면밀히 관찰합니다. 이후 3일 동안 진통제(예: Metacam, 1mg/kg)와 감염 예방을 위한 항생제(예: 엔로플록사신, 10mg/kg)를 피하로 투여합니다.
메모: 동물은 일반적으로 검사나 기록 전에 일주일 동안 수술 후 회복하도록 방치됩니다.
2. 소프트웨어 설치
참고: 이것은 Windows 10, 64비트 버전에서 테스트되었습니다.
- 데이터 수집 및 처리 소프트웨어를 설치합니다.
- Cheetah Acquisition System과 상호 작용할 수 있는 라이브러리가 포함된 데이터 수집 시스템 Cheetah 6.4(https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control)를 설치합니다.
- SpikeSort3D(https://neuralynx.com/software/spikesort-3d) 또는 스파이크 정렬을 위해 KlustaKwik27을 사용하는 기타 소프트웨어를 설치합니다. 온라인 탐지 소프트웨어는 KlustaKwik 엔진의 클러스터 정의를 사용합니다. 이 소프트웨어는 동일한 컴퓨터 또는 동일한 네트워크의 다른 컴퓨터에서 실행될 수 있습니다.
- https://neuralynx.com/software/netcom-development-package 에서도 다운로드할 수 있는 NetComDevelopmentPackage(https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0)를 설치합니다.
- Matlab을 설치합니다(https://www.mathworks.com/downloads/, 코드는 Matlab 버전 R2018a에서 테스트됨). Matlab이 Windows 방화벽에서 활성화되어 있는지 확인합니다. 일반적으로 첫 번째 연결 중에 팝업이 나타납니다.
- Matlab 계정에 로그인합니다. 라이선스를 선택합니다. 버전을 선택합니다. 운영 체제를 선택합니다.
- https://github.com/leomol/cheetah-interface 에서 온라인 이벤트 트리거링을 위한 다음 라이브러리를 다운로드하고 컴퓨터의 'Documents/Matlab' 폴더에 파일의 압축을 풉니다. 코드 사본은 함께 제공되는 추가 자료에 제공됩니다.
3. 초기 데이터 수집
- Cheetah 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집을 시작하십시오.
- 몇 분 분량의 스파이크 데이터를 기록하여 템플릿 파형을 채웁니다.
- 데이터 수집을 중지하고 기록된 데이터에 대해 스파이크 정렬을 수행합니다.
- SpikeSort3D를 열고 파일 | 메뉴 | 스파이크 파일을 로드하고 기록된 데이터가 있는 폴더에서 스파이크 파일을 선택합니다.
- Cluster Menu(클러스터 메뉴)를 클릭한 다음 Autocluster using KlustaKwik(KlustaKwik을 사용하여 자동 클러스터링)을 클릭하고 기본 설정을 그대로 두고 Run(실행)을 클릭합니다.
4. 폐쇄 루프 실험
- Cheetah에서 데이터 수집을 재개합니다.
- MATLAB을 엽니다.
- ClosedLoop.m을 열고 실행을 클릭합니다. 또는 Matlab 명령 창에서 ClosedLoop()를 실행합니다. ClosedLoop.m이 Matlab 경로에 있는지 확인합니다. 사용자가 모든 트리거를 호출하기 위해 사용자 지정 함수를 사용하려면 대신 ClosedLoop('-callback', customFunction)를 실행합니다. 여기서 customFunction은 해당 함수에 대한 핸들입니다.
- 로드를 클릭하고 녹음 폴더를 탐색하고 스파이크 데이터 파일(.ntt, .nse) 중 하나를 선택하여 초기 녹음에 정의된 스파이크 정보를 로드합니다.
- 플로팅된 파형 아래의 확인란을 클릭하여 자극을 트리거할 하나 이상의 뉴런을 선택합니다.
- 자극을 트리거할 뉴런의 최소 개수는 "min matches" 텍스트 상자에 정수를 입력하여 정의합니다. 그런 다음, 서로 다른 파형과 일치하는 스파이크가 동시 활성으로 간주되는 시간 창을 "창" 텍스트 상자에 숫자를 입력하여 정의합니다.
- 보내기를 클릭하여 시작합니다. 이것은 선택된 뉴런의 스파이크 활동을 기반으로 이벤트의 온라인 트리거링(기본적으로 톤)을 시작합니다.