쥐 뇌 절편에서 시냅스 사건의 광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록

초록

출처: Kinnavane, L., et al. 내측 전전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 생체 외 광유전학적 심문. J. Vis. 특급 (2022년)

이 비디오는 내측 전전두엽 피질(mPFC) 축삭을 광유전학적으로 자극하고 LEC에서 피라미드 뉴런의 반응을 기록하여 외측 내후각 피질(LEC)의 시냅스 효율성을 연구하는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 시냅스 가소성을 연구하기 위해 패치 클램프 녹음과 광 자극에 의한 시냅스 활성화를 결합합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 전기생리학 및 광유전학적 자극

1. 표적 세포의 식별.
   1. 연동 펌프로 2mL/분의 속도로 인공 뇌척수액(aCSF)이 관류된 34°C의 수중 기록 챔버에 슬라이스를 놓습니다. 슬라이스 앵커를 사용하여 슬라이스를 고정합니다.
   2. 경사 적외선 조명을 사용하는 광시야 현미경의 저배율(4x) 대물렌즈 아래에서 LEC(lateral enhorhinal cortex) 레이어 5로 이동합니다. 파이얼 표면에서 필요한 레이어까지의 거리를 측정합니다.
      메모: 경사 적외선 조명은 기록 챔버 커버슬립 아래 약 3mm에 근적외선 LED를 커버슬립 평면에 대해 ~55° 각도로 배치하여 달성되었습니다(그림 1B). 미분 간섭 대비는 슬라이스 전기생리학을 위한 대안적이고 일반적으로 사용되는 이미징 기술입니다.
   3. 고배율 침수 대물렌즈(40x)로 변경하고 피라미드 뉴런을 식별합니다. 컴퓨터 모니터에서 셀의 위치를 테이프로 표시합니다.
      메모: 피라미드 뉴런은 대략 삼각형 형태를 가지고 있으며, 두드러진 정점 수상돌기가 슬라이스의 pial 표면을 향해 돌출되어 있습니다(그림 2A). 세포 건강은 응축되고 눈에 보이는 핵이 없고 매끄럽게 보여야 하는 원형질막을 검사하여 평가할 수 있습니다. 옵신-형광단 융합 단백질에 의한 축삭돌기의 명확한 형광 표지는 광시야 형광 현미경을 사용할 때 볼 수 없을 것입니다. 축삭돌기 돌기를 시각화하려면 옵신의 형광단에 대한 1차 항체를 사용하여 사후 면역조직화학을 수행하고 동일하거나 유사한 파장의 형광단에 접합된 2차 항체로 증폭합니다.
2. 전체 세포 패치 클램프의 형성.​
   1. 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 마이크로피펫을 제작하고 여과된 세포 내 기록 용액(120mM k-글루코네이트, 40mM HEPES(N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산), 10mM KCl(염화칼륨), 2mM NaCl(염화나트륨), 2mM MgATP(마그네슘 아데노신 삼인산), 1mM MgCl(염화마그네슘), 0.3mM NaGTP(구아노신 삼인산나트륨), 0.2mM EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산), 및 UPW(초순수), pH 7.25, 285-300 mOsm)에서 만든 0.25% 바이오사이틴. 채워진 마이크로피펫을 패치-CL의 전극 홀더에 놓습니다.amp amp ampliifier 헤드stage, 전극 와이어가 세포 내 용액과 접촉하고 있는지 확인합니다.
   2. 전극 홀더 측면 포트에 튜브로 연결된 마우스피스(예: 플런저가 제거된 1mL 주사기)에 세게 불어 입으로 양압을 가하고 인라인 3방향 밸브를 닫아 압력을 유지합니다. 반월판이 형성되도록 현미경 대물렌즈를 올리고 현미경에서 볼 수 있을 때까지 전극을 반월판에 삽입합니다.
   3. WinLTP16(또는 기타 수집 소프트웨어/오실로스코프)에서 Seal Test 창을 열고 증폭기를 전압 클램프 모드로 설정한 상태에서 5mV 사각 펄스를 적용하여 피펫 저항이 3-6MΩ인지 확인합니다.
   4. 피펫 팁으로 식별된 세포에 접근하여 접촉하면 세포막이 움푹 들어가고(그림 2A, 오른쪽 패널) 피펫 저항(0.1MΩ)이 약간 증가합니다.
   5. 양압을 해제하고 마우스피스에 적당한 흡입을 가하여 음압을 가하십시오. 이로 인해 피펫 저항(>1000MΩ)이 크게 증가합니다. 이제 압력을 중립으로 둘 수 있습니다. 세포막이 파열되어 전체 세포 정전 용량 과도 현상이 발생할 때까지 점진적으로 증가하는 램프에서 음압을 가합니다.
3. 광유전학적으로 유발된 시냅스 사건을 기록합니다.
   1. current-clamp configuration.
      입력 참고: 대부분의 경우, 장거리 시냅스 전달은 글루타메이터성이므로 염화물 역전 전위에 가까운 막 전위에서 기록하면 AMPA 수용체(AMPAR) 매개 전달을 가장 잘 분리하고 유발된 피드포워드 억제(FFI)의 측정을 최소화할 수 있습니다. 염화물 반전은 세포 내 기록 용액 및 aCSF의 조성에 따라 달라지며 Goldman-Hodgkin-Katz 방정식을 사용하여 계산할 수 있습니다. 위 솔루션의 경우 -61.3mV였습니다. 레이어 5 LEC 피라미드 뉴런은 평균 휴지막 전위가 -62mV였으며 필요한 경우 정전류를 주입하여 이 전위를 유지했습니다. 또는 셀을 원하는 전위로 전압 클램핑할 수 있습니다. 장거리 억제 투영을 기록하거나16 FFI를 기록하기 위해 GABAergic 염화물 전도도를 분리하기 위한 양이온 반전 전위에서 전압 클램프를 기록합니다. 막 전위가 활동 전위 임계값을 초과하는 전압 클램핑 뉴런의 경우, 전압 클램프를 개선하고 활동 전위(130mM CsMeSO4(세슘 메탄설포네이트), 10mM HEPES, 8m NaCl, 5mM QX 314 염화물, 4mM MgATP, 0.5mM EGTA, 0.3mM NaGTP, UPW에서 만든 0.25% 바이오사이틴, pH 7.25, 285-300 mOsm)을 참조하십시오.
   2. 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 TTL(Transistor-Transistor Logic) 신호를 LED(발광 다이오드) 드라이버로 전송하여 장착된 470nm LED를 활성화합니다. 장착된 LED는 필터 큐브와 적절한 광학 장치(그림 1B)를 사용하여 현미경 광 경로로 향하게 되어 40x 대물렌즈를 통해 슬라이스에 광 펄스를 적용하여 광유전학적 흥분성 시냅스 후 전위(oEPSP)를 유발합니다.
      메모: 광 펄스는 perisomatically/수상돌기 위에 적용될 수 있으며, 이로 인해 축삭 및 시냅스전 보톤에서 옵신이 활성화되거나 조사자가 과도한 부톤 자극을 피하기 위해 기록된 세포에서 멀리 떨어진 축삭으로 목표를 이동할 수 있습니다. 최대 oEPSP 진폭은 시냅스 돌기의 강도, 바이러스 주사의 효능 및 사용된 옵신에 따라 달라집니다. oEPSP는 광도 및/또는 지속 시간을 변경하여 원하는 진폭으로 적정할 수 있습니다18; 광 펄스의 지속 시간(최대 LED 전력 출력에서 0.2-5ms 사이의 일반적인 지속 시간, 4.4mW/mm의 광 밀도19)을 변경하면 LED의 전력 출력을 변경하는 것보다 더 일관된 oEPSP 진폭을 얻을 수 있습니다.
   3. 서로 다른 인터-스티뮬러스 간격(inter-stimulus interval)을 가진 여러 광 펄스의 트레인을 전달하여 시냅스전 방출 특성(전압 변화)을 조사합니다(그림 2E). 광유전학적으로 유발된 전송을 해석하는 동안 주의를 기울여야 합니다.
   4. oEPSPs19를 반복적으로 유발하거나 리간드를 적용하여 장기적인 가소성을 조사합니다. 가소성 유도 전에 안정성을 보장하기 위해 5-10분 동안 oEPSP 진폭을 모니터링한 다음 안정적인 진폭(일반적으로 30-40분)에 도달할 때까지 모니터링합니다.
      메모: 대부분의 현재 옵신은 고주파에서 여러 활동 전위를 안정적으로 불러일으킬 수 없습니다(예: 일반적으로 LTP를 유도하는 데 사용되는 100Hz에서 전달되는 100개의 자극
   ).
   5. oEPSP가 단시냅스인지 확인하려면 수지상 아버 위에 대물렌즈를 배치하고 0.5μM 테트로도톡신 및 100μM 아미노피리딘이 있는 상태에서 자극하여 형질도입된 경로의 과부톤 활성화를 수행합니다. 테트로도톡신의 적용은 반응이 활동 전위에 의존하는 경우 전염을 없애고, 이후에 아미노피리딘을 포함하면 oEPSP가 단시냅스로 생성되면 투과를 부분적으로 회복할 수 있습니다19,20.
   6. 바이오사이틴이 뉴런을 채울 수 있도록 하려면 전체 세포 구성에 들어간 후 최소 15분 동안 기다립니다. 전압 클램프에서 멤브레인 커패시턴스와 입력 저항을 모니터링합니다.
   7. 세포의 소마에서 멀어지는 접근 각도를 따라 피펫을 천천히 빼내면서 커패시턴스 과도 현상과 멤브레인 전류가 천천히 사라지는 것을 관찰하여 세포막이 다시 밀봉되고 피펫 팁에서 외부 패치가 형성됨을 나타냅니다. 슬라이스의 방향과 슬라이스 내의 셀 위치를 기록해 둡니다. 슬라이스를 24웰 플레이트의 PFA(파라포름알데히드)에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 다음 0.1M PB.
      로 옮깁니다. 메모: 슬라이스는 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다. 더 오래 보관해야 하는 경우 PB(인산염 완충액)를 정기적으로 교체하거나 아지드화나트륨(아지드화나트륨 0.02%-0.2%)이 함유된 PB를 사용하십시오.

결과

그림 1: 시각화된 전체 세포 기록, 광유전학적 흥분 및 td토마토 양성 뉴런 식별을 위한 절편 수집 챔버 및 광학 구성. (A) 슬라이스 수집 챔버(14)는 나일론 메쉬 시트에 접착된 마이크로 원심분리기 튜브 랙으로 맞춤 제작되고 비커에 삽입되어 CSF에 담근다. (B) ChR2(채널로돕신-2)(470nm) 및 td토마토(565nm)의 여기(excitation)를 위한 LED는 비구면 콘덴서 렌즈를 통해 빛을 시준하고, 565nm 빛은 대역 통과 필터를 통해 빔되어 tdTomato 여기 및 방출 스펙트럼의 스펙트럼 분리를 달성합니다. 이들은 long-pass dichroic mirror와 결합되어 더 긴 파장의 두 번째 long-pass dichroic mi...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3방향 루어 밸브	콜-파머	WZ-30600-02
40x 대물렌즈	올림푸스	LUMPLFLN40XW
4-아미노피리딘	안녕하세요 바이오	HB1073
4x 대물렌즈	올림푸스	PLN4X/0.1
무채색 렌즈	에드몬드 옵틱	49,363	시각 스펙트럼 및 근적외선에 초점 맞추기
탁상형 마이크로 원심분리기	벤치마크 사이언티픽	C1005*
바이오사이틴	시그마-알드리치	나4261
Borosillicate 유리 모세관	워너 인스트루먼트	G150F-6
염화나트륨2	시그마-알드리치	C5670 (영문
카메라 - Qimaging Retiga Electro	포토메트릭스	01 - 전기 M - 14 - C
카르바촐	토크리스	2810
클로르헥시딘 수술용 스크럽	베타셉트	XHG008
클리퍼 스	안디스	22445	AGC 슈퍼 2단 탈착식 블레이드 클리퍼
Collimation condenser lens (시준 콘덴서 렌즈	토르랩스	ACL2520-A
커버슬립	피셔 사이언티픽 주식회사	10011913
저온 유지 장치	라이카	CM3050 에스
CSM메SO4	시그마-알드리치	C1426 (영문
시아노아크릴레이트 접착제	래피드 일렉트로닉스 주식회사	84-4557
데이터 수집 장치	내쇼날인스트루먼트	USB-6341 BNC
D-포도당	시그마-알드리치	G8270
다이크로익 미러 500 nm long-pass	에드몬드 옵틱	69899
다이크로익 미러 600 nm long-pass	에드몬드 옵틱	69901
다이크로익 미러 큐브	토르랩스	CM1-DCH/남
에그타	밀포어	324626
측면 포트가 있는 전극 홀더	헤카	895150
방출 필터	크로마	59022엠
여기 필터	크로마	ET570/20배
아이 젤	데크라	루브리탈
고급 페인트 브러시	과학 실험실 용품	BRU2052
단두대	세계적인 정밀 기기	DCAP
헤페스	시그마-알드리치	H3375 (영문
과산화수소 용액	시그마-알드리치	H1009	30% (승/패)
이소플루란	헨리 샤인	Tel.988-3245
이소펜탄	시그마-알드리치	M32631
케이클	시그마-알드리치	P3911
K-글루코네이트	시그마-알드리치	G4500
Kinematic 형광 필터 큐브	토르랩스	재질 보기 DFM1T1
LED 드라이버	토르랩스	LED1B
마그네슘 ATP	시그마-알드리치	A9187
마그네슘Cl	시그마-알드리치	M2670
마그네슘SO4	시그마-알드리치	M7506
미세 전극 풀러	셔터 기기	P-87
마이크로사출 주사기	해밀턴	7634-01/00
미세주입 주사기 바늘	해밀턴	7803-05	사용자 정의 사양 : 게이지 33, 길이 15mm, 포인트 스타일 4 - 12 °
마이크로사출 주사기 펌프	세계적인 정밀 기기	UMP3T-1
장착된 청색 LED	토르랩스	M470L5
나2HPO4.7H2O	시그마-알드리치	S9390
염화나트륨	시그마-알드리치	S9888
나GTP	시그마-알드리치	G8877
나H2PO4	시그마-알드리치	S0751
나H2PO4.H2O	시그마-알드리치	S9638
나HCO3	시그마-알드리치	S5761
NIR LED	오스람	SFH4550	슬라이스의 굴절된 IR 이미징에 사용되는 DIC(differential interference contrast) 광학 장치는 일반적으로 사용되는 또 다른 방법입니다
파라포름알데히드	시그마-알드리치	158127
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148
패치 클램프 증폭기	분자 장치	700ᅡ
연동 펌프	세계적인 정밀 기기	미니스타
Poly-L-lysine 코팅 현미경 슬라이드	피셔 사이언티픽 주식회사	전화: 23-769-310
녹음실	워너 인스트루먼트	RC-26G
슬라이스 앵커	워너 인스트루먼트	SHD-26-GH/15
마이크로 드릴용 입체택시 홀더	하버드 기구	75-1874
자당	시그마-알드리치	S0389
외과 현미경	칼 자이스	OPMI 1 FR 프로
세포 내 기록 용액을 위한 주사기 필터	Thermo Scientific Nalgene	Tel.: 171-0020
정립 형광 현미경	라이카	DM6 B
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