Microelectrode-Mediated FM Dye loading and unloading in Drosophila 유충 신경 세포의 검출기

초록

출처: Kopke, D. L., et al., 시냅스에서 FM 염료 순환: 높은 칼륨 탈분극, 전기 및 채널 로돕신 자극 비교. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오에서 초파리 유충 신경 섬유는 세포막 지질에 결합하는 FM 염료에 잠겨 있습니다. 흡입 미세전극 및 전기 펄스는 세포내이입 과정을 자극하여 FM 염료를 새로 형성된 세포내포에 통합합니다. 신경 전달의 시냅스 전 단계를 시각화하는 이 방법은 시냅스 기능과 신경전달물질 방출을 연구하는 데 유용합니다.

프로토콜

1. 애벌레 접착제 해부

1. 실리콘 엘라스토머 베이스 10부와 엘라스토머 키트의 실리콘 엘라스토머 경화제 1부를 완전히 혼합합니다.
2. 22 x 22mm 유리 커버슬립을 엘라스토머로 코팅하고 75°C의 핫 플레이트에서 몇 시간 동안 경화합니다(만졌을 때 더 이상 끈적거리지 않을 때까지).
3. 유충 해부를 위해 맞춤형 플렉시 유리 해부 챔버에 단일 엘라스토머 코팅 유리 커버슬립을 놓습니다.
4. 원하는 테이퍼와 팁 크기를 얻기 위해 표준 미세 전극 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관에서 접착제 피펫을 준비합니다.
5. 마이크로피펫 팁을 부드럽게 떼어내고 다른 쪽 끝에는 2피트의 유연한 플라스틱 튜브(1/32" 내경, ID; 3/32" 외경, OD, 1/32" 벽, 입 피팅 포함(P2 피펫 팁))를 부착합니다.
6. 유충 박리를 준비하기 위해 작은 용기(0.6 mL Eppendorf 튜브 캡)에 소량(~20 μL)의 접착제를 채웁니다.
7. 챔버를 식염수로 채웁니다 (mM) : 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 자당 및 5 2- [4- (2- 하이드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 일] 에탄 술폰산 (HEPES) pH 7.2.
8. Alexa Fluor 647에 접합된 항-말무 과산화효소(HRP) 항체(anti-HRP:647, 1mg/mL 스톡에서 1:10 희석)를 추가하여 해부 중 NMJ 시냅스전 말단을 라벨링합니다21,22.
9. 가는 붓(크기 2)을 사용하여 식품 바이알에서 떠다니는 세 번째 instar를 제거하고 엘라스토머로 코팅된 커버 유리에 놓습니다.
10. 부착물이 부착된 입에서 생성된 음의 기압을 사용하여 유리 마이크로피펫 팁에 소량의 접착제를 채웁니다(단계 1.5).
11. 집게로 유충의 등쪽을 위로 향하게 놓고 입으로 양압을 사용하여 작은 접착제 한 방울로 엘라스토머 코팅된 커버슬립에 머리를 붙입니다.
12. 유충의 뒤쪽 끝으로 이 절차를 반복하여 동물이 두 접착제 부착물 사이에서 팽팽하게 늘어나도록 합니다.
13. 가위(날 3mm)를 사용하여 뒤쪽을 수평으로 자르고(~1mm) 등 쪽 정중선을 따라 수직으로 자릅니다.
14. 가는 집게(#5)를 사용하여 등쪽 기관, 장, 지방체 및 근육 조직을 덮고 있는 기타 내부 장기를 부드럽게 제거합니다.
15. 4개의 몸체 벽 플랩에 대해 접착 절차를 반복하고 몸체 벽을 수평 및 수직으로 부드럽게 늘립니다.
16. 집게를 사용하여 복부 신경삭(VNC)을 들어 올리고 가위로 운동 신경을 조심스럽게 자른 다음 VNC를 완전히 제거합니다.
17. SV 순환을 중지하려면 박리 식염수를 Ca²⁺-free 식염수(CaCl₂가 없는 위의 절제 식염수와 동일)로 교체하십시오.

2. 전기 자극 FM 염료 로딩

1. 미세 전극 풀러를 사용하여 흡입 피펫을 준비하여 필요한 테이퍼와 팁 크기를 얻습니다.
2. 단일 운동 신경이 단단히 끼워져 빨려 들어갈 수 있을 때까지 마이크로 포지로 미세 전극 팁을 화염 연마합니다.
3. 흡입 피펫을 마이크로 매니퓰레이터의 전극 홀더에 밀어 넣고 길고 유연한 플라스틱 튜브와 주사기에 부착합니다.
4. 자극기 매개변수(예: 15V, 20Hz 주파수, 20ms 지속 시간, 5분 또는 1분)를 설정합니다.
5. 유충 준비의 Ca²⁺-free 식염수를 전기생리학 리그에서 위의 FM1-43 식염수(4μM; 1mM CaCl₂)로 교체합니다.
6. 현미경 스테이지에 준비물을 놓고 유충과 흡입 파이펫이 초점을 맞출 때까지 스테이지를 올립니다(40X 침수 대물렌즈).
7. 주사기에 의해 생성된 음의 공기압으로 선택한 반분점을 신경을 자극하는 절단 운동 신경의 루프를 흡입 전극으로 빨아들입니다.
8. 짧은 자극으로 흡입 전극 기능을 테스트하면서 선택한 반분절의 근육 수축을 육안으로 모니터링합니다.
9. SV 세포내이입 및 FM1-43 염료 흡수를 유도하기 위해 선택된 매개변수(2.4단계)를 사용하여 운동 신경을 자극합니다.
10. Ca²⁺-free 식염수(5분간 1회)로 빠르게 세척하여 FM1-43 염료 용액을 완전히 제거합니다.
11. 위의 컨포칼 이미징 프로토콜을 사용하여 즉각적인 이미징을 위해 신선한 Ca²⁺-free 식염수에서 유충 준비를 유지합니다.
12. NMJ 이미지(분절, 측면 및 근육)를 주의 깊게 기록하여 FM 염료 언로딩 후 동일한 NMJ에 액세스할 수 있도록 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SylGard 184 실리콘 엘라스토머 키트	피셔 사이언티픽	NC9644388	해부를 위해 커버 유리를 씌우기 위해
현미경 커버 유리 22x22-1	피셔브랜드	12-542-B	해부를 위해 SylGard를 착용하기 위해
알루미늄 상부 핫 플레이트 타입 2200	써모린	HPA2235M	실가드를 치료하기 위해
플렉시 유리 해부 챔버	해당 사항 없음	해당 사항 없음	손으로 만든
붕규산 유리 모세 혈관	WPI (영어)	AN-번호 1B100F-4	흡입 및 접착제 마이크로 피펫을 만들기 위해
레이저 기반 마이크로피펫 풀러	셔터 계기	P-2000	흡입 및 접착제 마이크로 피펫을 만들기 위해
Tygon E-3603 실험실 튜빙	Component Supply Co. (구성 요소 공급 회사)	TET-031A	입 및 흡입 피펫용
P2 피펫 팁	미국 과학	제1111-3700	입 피펫용
0.6-mL Eppendorf 튜브 캡	피셔 사이언티픽	05-408-120	해부를 위해 접착제를 넣는 데 사용됩니다.
베트본드 3M	WPI (영어)	베트본드	해부에 사용되는 접착제
염화칼륨	피셔 사이언티픽	P-217	포살린
소금	밀리포어 시그마	S5886	식염수용
염화마그네슘	피셔 사이언티픽	엠35-500	식염수용
Calcium Chloride Dihydrate (염화칼슘 이수화물)	밀리포어 시그마	C7902	식염수용
자당	피셔 사이언티픽	시즌 5-3	식염수용
헤페스	밀리포어 시그마	H3375 (영문	식염수용
HRP : 알렉사 플루어 647	잭슨 이뮤노리서치	Tel.: 123-605-021	신경세포막(neuronal membranes)을 라벨링하기 위해
화필	윈저 & 뉴턴	94376864793	유충을 조작하기 위해
Dumont Dumostar 핀셋 #5	WPI (영어)	500233	해부 중에 사용
7cm McPherson-Vannas 마이크로 가위(블레이드 3mm)	WPI (영어)	14177	해부 중에 사용
FM1-43	피셔 사이언티픽	T35356	형광 스티릴 염료
디지털 타이머	폭스바겐	62344-641	FM 염료 로드/언로드 타이밍용
마이크로 포지	WPI (영어)	MF200	광택 유리 마이크로피펫을 화재로 만들기 위해
20mL 주사기 슬립 팁	BD (영어)	301625	전기 자극을 위해 축삭을 빨아들입니다.
마이크로 매니퓰레이터(마그네틱베이스)	나리시게	MMN-9	전기 자극을 위한 흡입 전극을 제어하기 위해
자극	풀	시즌 48	LED 및 전기 자극을 제어하기 위해
Zeiss Axioskop 현미경	자이스		전기 자극 중에 사용됩니다.
40X Achroplan Water Immersion 대물렌즈	자이스		전기 자극 및 공초점 이미징에 사용
카메라 포트가 있는 Zeiss Stemi 현미경	자이스	2000-씨	채널로돕신 자극 시 사용
T-Cube LED 구동기	토르랩스	LED1B	LED를 제어하려면
LED 전원 공급 장치	Cincon 전자 (주)	TR15RA150	LED에 전원을 공급하려면
광학 전력 및 에너지 미터	토르랩스	미세먼지100D	LED 강도를 측정하려면