Gingerphila 유충의 시냅스 소포 재활용 및 형광 염료 흡수 분석

초록

출처: Kopke, D. L., et al., FM 시냅스에서의 염료 순환: 높은 칼륨 탈분극, 전기 및 채널로돕신 자극 비교. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 형광 염료를 사용하여 채널로돕신 발현 초파리 유충의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 청색광은 채널로돕신을 활성화하여 칼슘 유입과 시냅스 소포 외포작용(synaptic vesicle exocytosis)을 일으킵니다. 염료는 신경세포막에 통합되고 세포내이입 중에 내부화되어 형광이 향상됩니다. 추가적인 청색광 자극은 엑소사이토시스(exocytosis)와 염료 방출을 유도하며, 이는 형광 감소로 나타납니다.

프로토콜

1. 유충 접착제 해부

1. 엘라스토머 베이스의 10부와 엘라스토머 키트의 실리콘 엘라스토머 경화제 1부를 완전히 혼합합니다(재료 표).
2. 22 x 22mm 유리 커버슬립을 엘라스토머로 코팅하고 75°C의 핫 플레이트에서 몇 시간 동안 경화합니다(만졌을 때 더 이상 끈적거리지 않을 때까지).
3. 유충 해부를 준비하기 위해 단일 엘라스토머 코팅된 유리 커버슬립을 맞춤형 플렉시글라스 해부실(그림 1, 하단)에 넣습니다.
4. 원하는 테이퍼와 팁 크기를 얻기 위해 표준 미세 전극 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관에서 접착제 피펫을 준비합니다.
5. 마이크로피펫 팁을 부드럽게 떼어내고 다른 쪽 끝에 2피트의 유연한 플라스틱 튜브(1/32" 내경, ID; 3/32" 외경, OD; 1/32" 벽; 재료 표) 입 피팅 포함(P2 피펫 팁).
6. 유충 해부를 준비하기 위해 작은 용기(0.6 mL Eppendorf tube cap)에 소량(~20 μL)의 접착제(Table of Materials)를 채웁니다.
7. 챔버를 식염수로 채웁니다 (mM) : 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 자당 및 5 2- [4- (2- 하이드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 일] 에탄 술폰산 (HEPES) pH 7.2.
8. Alexa Fluor 647에 접합된 항-말무 과산화효소(HRP) 항체(anti-HRP:647, 1mg/mL 스톡에서 1:10 희석)를 추가하여 박리 중 신경근 접합부(NMJ) 시냅스전 말단을 라벨링합니다.
9. 가는 붓(크기 2)을 사용하여 식품 바이알에서 떠도는 세 번째 instar 유충을 제거하고 엘라스토머로 코팅된 커버 유리에 놓습니다.
10. 부착물이 부착된 입에서 생성된 음의 기압을 사용하여 유리 마이크로피펫 팁에 소량의 접착제를 채웁니다(단계 1.5).
11. 유충의 등쪽을 집게로 위로 향하게 놓고 입으로 양압을 사용하여 작은 접착제 한 방울로 엘라스토머로 코팅된 커버슬립에 머리를 붙입니다.
12. 유충의 뒤쪽 끝으로 이 절차를 반복하여 동물이 두 접착제 부착물 사이에 팽팽하게 늘어나 있는지 확인합니다.
13. 가위 사용 (블레이드 3mm; Table of Materials)에서 후방으로 수평 절단(~1mm)을 하고 등쪽 정중선을 따라 수직 절단을 합니다.
14. 가는 집게(#5, Table of Materials)를 사용하여 등쪽 기관, 장, 지방체 및 근육 조직을 덮고 있는 기타 내부 장기를 부드럽게 제거합니다.
15. 4개의 몸체 벽 플랩에 대해 접착 절차를 반복하여 몸체 벽을 수평 및 수직으로 부드럽게 늘립니다.
16. 집게를 사용하여 복부 신경삭(VNC)을 들어 올리고 가위로 운동 신경을 조심스럽게 자른 다음 VNC를 완전히 제거합니다.
17. 절제 식염수를 Ca²⁺-free 식염수(CaCl₂가 없는 위의 절제 식염수와 동일)로 교체하여 시냅스 소포(SV) 순환을 중지합니다.

2. 이미징 : 컨 포칼 현미경

1. 40X Water Immersion 대물렌즈가 있는 정립 컨포칼 현미경을 사용하여 NMJ 염료 형광을 이미지화합니다(다른 현미경을 사용할 수 있음).
2. 복부 분절 2-4의 근육 4 NMJ를 이미지화하고(다른 NMJ를 이미지화할 수 있음) 적절한 소프트웨어(Table of Materials)를 사용하여 이미지를 수집합니다.
3. HeNe 633 nm 레이저를 사용하여 HRP:647(635 nm> 장역 통과 필터 사용)을 여기하고 Argon 488 nm 레이저를 사용하여 FM1-43(530-600 nm 대역 통과 필터 사용)을 여기합니다.
4. 두 채널 모두에 대한 최적의 게인 및 오프셋을 운영적으로 결정합니다.
   메모: 이러한 설정은 실험의 나머지 부분 동안 일정하게 유지됩니다.
5. HRP로 표시된 시냅스 말단의 상단에서 하단으로 선택한 전체 NMJ를 통해 컨포칼 Z-스택을 취합니다.
6. FM 염료 언로딩 후 정확히 동일한 NMJ가 초과되도록 하기 위해 이미징된 NMJ(세그먼트, 측면 및 근육)를 주의 깊게 기록하십시오.

3. Channelrhodopsin 자극 FM 염료 로딩

1. ChR2 보조 인자인 all-trans retinal(에탄올에 용해됨, 100μM 최종 농도)을 함유한 식품에서 ChR2 발현 유충을 높입니다.
2. 카메라 포트가 장착된 해부 현미경 스테이지의 플렉시글라스 챔버에 유충 제제를 놓습니다.
3. 파란색 LED(470nm; 재료 표) 동축 케이블을 사용하여 프로그래밍 가능한 자극기에 연결하고 LED를 카메라 포트에 배치합니다.
4. 현미경 줌 기능을 사용하여 파란색 LED 광선을 절개된 유충 기능에 초점을 맞춥니다.
5. 유충 제제의 Ca²⁺-free 식염수를 광유전학적 단계에서 위의 FM1-43 식염수(4 μM; 1 mM CaCl₂)로 교체합니다.
6. 자극기를 사용하여 LED 매개변수를 설정합니다(예: 15V, 20Hz 주파수, 20ms 지속 시간 및 5분 시간(그림 2)).
7. 광 자극을 시작하고 광유전학적 자극 기간의 미리 결정된 기간(예: 5분; 그림 2).
8. 타이머가 멈추면 FM 염료 용액을 빠르게 제거하고 Ca²⁺-free 식염수로 교체하여 SV 사이클링을 중지합니다.
9. FM 염료 용액이 완전히 제거되도록 Ca²⁺-free 식염수(5분간 1회)로 빠르게 연속적으로 세척합니다.
10. 이미징 프로토콜을 사용하여 컨포칼 현미경으로 즉시 이미징할 수 있도록 신선한 Ca²⁺-free 식염수로 유충 준비를 유지합니다.
11. FM 염료 언로딩 후 정확히 동일한 NMJ에 접근할 수 있도록 이미징된 NMJ(세그먼트, 측면 및 근육)를 주의 깊게 기록하십시오.

4. Channelrhodopsin 자극 : FM 염료 언 로딩

1. 해부 현미경 스테이지에서 Ca²⁺-free 식염수를 일반 식염수(FM1-43 염료 제외)로 교체하고 카메라 포트 LED가 유충에 초점을 맞춥니다.
2. 언로딩을 위한 자극기 매개변수를 설정합니다(예: 15V, 20Hz 주파수, 20ms 지속 시간 및 2분 시간(그림 2).
3. 광 자극을 시작하고 광유전학적 자극 기간의 미리 결정된 지속 시간(예: 2분; 그림 2).
4. 타이머 기간이 끝나면 FM 염료 용액을 빠르게 제거하고 Ca²⁺-free 식염수로 대체하여 SV 사이클링을 중지합니다.
5. Ca²⁺-free 식염수(5회, 1분)로 빠르게 연속해서 세척하여 외부 염료가 완전히 제거되었는지 확인합니다.
6. 컨포칼 현미경으로 즉시 이미징할 수 있도록 신선한 Ca²⁺-free 식염수로 유충 준비를 유지합니다.
7. 동일한 컨포칼 설정을 사용하여 위에서 언급한 것과 동일한 NMJ에서 FM1-43 염료 형광을 이미지화해야 합니다.

결과

그림 1: Drosophila NMJ에서 FM1-43 염료 로딩 프로토콜의 흐름도. 유충 접착제 해부는 복부 신경삭스(VNC)가 복부 정중선(Vm)에서 반분절 반복되는 체벽 근육 배열(단계 a)까지 분절 신경을 투영하여 평평한 신경근 조직을 생성합니다. VNC를 절단하고 전체 유충 해부를 분홍색 FM1-43 용액(4μM)에서 배양하여 자극을 준비합니다(단계 b). 그런 다음 FM1-43에 선택된 자극 패러다임이 로드됩니다(3단계). 전체 유충의 높은 [K+] 탈분극(cI), 단일 운동 신경(cII)의 흡입 전극 자극 또는 고도로 표적화된 채널로돕신(cIII)의 광 구동 활성화 옵션이 있습니다. FM1-43 혼입은 Ca2+-free 식염수와 염료가 적재된 NMJ를 사용하여 검출됩니다(단계 d). 그런 다음 염료 시냅스 소...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SylGard 184 실리콘 엘라스토머 키트	피셔 사이언티픽	NC9644388	해부를 위해 커버 유리를 씌우기 위해
현미경 커버 유리 22x22-1	피셔브랜드	12-542-B	해부를 위해 SylGard를 착용하기 위해
알루미늄 상부 핫 플레이트 타입 2200	써모린	HPA2235M	실가드를 치료하기 위해
플렉시 유리 해부 챔버	해당 사항 없음	해당 사항 없음	손으로 만든
붕규산 유리 모세 혈관	WPI (영어)	AN-번호 1B100F-4	흡입 및 접착제 마이크로 피펫을 만들기 위해
레이저 기반 마이크로피펫 풀러	셔터 계기	P-2000	흡입 및 접착제 마이크로 피펫을 만들기 위해
Tygon E-3603 실험실 튜빙	Component Supply Co. (구성 요소 공급 회사)	TET-031A	입 및 흡입 피펫용
P2 피펫 팁	미국 과학	제1111-3700	입 피펫용
0.6-mL Eppendorf 튜브 캡	피셔 사이언티픽	05-408-120	해부를 위해 접착제를 넣는 데 사용됩니다.
베트본드 3M	WPI (영어)	베트본드	해부에 사용되는 접착제
염화칼륨	피셔 사이언티픽	P-217	포살린
소금	밀리포어 시그마	S5886	식염수용
염화마그네슘	피셔 사이언티픽	엠35-500	식염수용
Calcium Chloride Dihydrate (염화칼슘 이수화물)	밀리포어 시그마	C7902	식염수용
자당	피셔 사이언티픽	시즌 5-3	식염수용
HRP : 알렉사 플루어 647	잭슨 이뮤노리서치	Tel.: 123-605-021	신경세포막(neuronal membranes)을 라벨링하기 위해
헤페스	밀리포어 시그마	H3375 (영문	식염수용
화필	윈저 & 뉴턴	94376864793	유충을 조작하기 위해
Dumont Dumostar 핀셋 #5	WPI (영어)	500233	해부 중에 사용
7cm McPherson-Vannas 마이크로 가위(블레이드 3mm)	WPI (영어)	14177	해부 중에 사용
FM1-43	피셔 사이언티픽	T35356	형광 스티릴 염료
디지털 타이머	폭스바겐	62344-641	FM 염료 로드/언로드 타이밍용
LSM 510 META 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	자이스		형광 마커 이미징용
Zen 2009 SP2 버전 6.0	자이스		공초점 이미징을 위한 소프트웨어
HeNe 633nm 레이저	라소스	이미징 중 HRP:647을 자극하기 위해
아르곤 488nm 레이저	라소스		이미징 중 FM 염료를 자극하기 위해
마이크로 포지	WPI (영어)	MF200	광택 유리 마이크로피펫을 화재로 만들기 위해
자극	풀	시즌 48	LED 및 전기 자극을 제어하기 위해
올 트랜스 망막	밀리포어 시그마	R2500	ChR2에 대한 필수 보조 인자
카메라 포트가 있는 Zeiss Stemi 현미경	자이스	2000-씨	채널로돕신 자극 시 사용
주도의 470nm	토르랩스	M470L2	ChR 활성화에 사용됨
T-Cube LED 구동기	토르랩스	LED1B	LED를 제어하려면
LED 전원 공급 장치	Cincon 전자 (주)	TR15RA150	LED에 전원을 공급하려면
광학 전력 및 에너지 미터	토르랩스	미세먼지100D	LED 강도를 측정하려면
40X Achroplan Water Immersion 대물렌즈	자이스	전기 자극 및 공초점 이미징에 사용