쥐의 시상하핵(subthalamic nucleus)에 전극을 이식하는 단계

초록

출처: Fluri, F., et al., 장기 뇌 심부 자극을 위해 쥐의 시상하핵에 전극을 유도하는 미세 전극 유도 이식. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 쥐의 시상하핵에 전극을 이식하여 전기 자극을 전달하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마취

1. 마취 시스템을 점검하여 시술 기간 동안 가스(산소)와 이소플루란이 적절하게 공급되는지 확인하십시오. 노즈콘을 정위 기구의 앞니 막대에 연결하고 앞니 막대를 -3.3mm로 설정합니다.
2. 공급 가스(2L/min)를 켭니다. 쥐를 상자에 넣고 윗부분을 밀봉하십시오. 이소플루란 기화기를 3.5%로 켭니다.
3. 쥐가 누워있을 때 마취 가스가 앞니 막대에 고정된 노즈콘으로 흐르도록 시스템을 전환합니다.
4. 상자 챔버에서 쥐를 제거하고 귀와 눈 사이의 영역을 면도하십시오. Jodosept PVP에 적신 면봉을 사용하여 면도 부위를 면봉으로 닦아 느슨한 머리카락을 제거하십시오.
5. 쥐를 노즈콘(그림 1)에 놓고 O_2.5(1L/min)에서 이소플루란을 2.5%로 마취를 계속합니다. interdigital 영역을 꼬집어 마취 수준을 확인하십시오. 쥐가 적절하게 마취되면 방어 반사 신경(즉, 발의 철회)이 사라집니다.
6. 시술 중 호흡과 자극에 대한 반응을 모니터링하고 필요에 따라 기화기를 조정하십시오.
7. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오. 피드백 제어 난방 시스템은 체온을 37°C± 0.5°C로 모니터링하고 유지합니다.

2. 수술

1. 전체 수술 동안 수술 부위를 무균 상태로 유지하십시오. 외과 의사의 손과 수술 부위가 멸균되면 조심스럽게 움직이고 멸균 상태를 깨지 않도록 기억하십시오. 여기에는 기구를 내려놓을 수 있는 멸균 영역(예: 멸균 방수 커튼)이 포함됩니다.
2. 0.2ml의 메피바카인을 면도 부위 중앙에 피하주사합니다. 메피바카인은 최대 3시간의 작용 지속시간을 가진 국소 마취제입니다. 수술 부위를 더욱 마취시킵니다.
3. 메스를 사용하여 귀 사이부터 2cm까지 정중선을 절개합니다.골막(피부 아래의 반짝이는 막)도 절개해야 합니다. 4개의 클램프로 두개골을 노출시킵니다(그림 2).
4. 면봉을 사용하여 관상복선과 시상봉합사가 드러날 때까지 골막을 부드럽게 제거한 다음 면봉으로 혈액을 닦습니다.
5. 프로브 홀더에 고정된 바늘을 사용하여 브레그마의 좌표를 결정한 다음 검은색 펠트 펜으로 바늘 끝을 표시합니다. 전방/후방(AP), 정중선/외측(ML) 및 배복부(DV) 구동 나사를 사용하여 바늘 끝을 브레그마 바로 위에 놓습니다.
6. AP 및 ML 버니어 눈금 판독값을 취합니다: 오른쪽 STN에 전극 이식을 위해 AP 판독값에서 3.6mm를 빼고 ML 판독값에서 2.5mm를 빼거나 왼쪽 STN에 전극 이식을 위해 2.5mm를 추가합니다. 이 위치는 바늘 끝을 두개골 표면으로 내린 후 펠트 펜의 염료에 의해 표시됩니다.
7. Clamp 치과용 드릴을 입위 기구의 대형 프로브 홀더에 끼웁니다. 치과 드릴을 계산된 영역, 즉 두개골에 표시된 지점으로 이동합니다. 현미경을 통해 경막이 보일 때까지 두개골을 통해 구멍(직경 약 1mm)을 뚫습니다(두개골 두께는 약 1mm). 미세 해부 겸자 또는 멸균 바늘을 사용하여 경막을 수축시킵니다. 듀라는 전극의 끝을 파괴할 만큼 충분히 단단합니다.
8. 치과 드릴로 각 정면 편평과 전극 구멍 맞은편에 있는 두정간 편평골에 구멍을 뚫습니다. 입체 기기에서 프로브 홀더를 분리합니다. 정맥 혈관이 두개골 아래의 봉합선을 따라가므로 두개골 봉합사에 구멍을 뚫지 마십시오.
9. 5개의 구멍 각각에 뼈 나사를 조입니다. 나사를 너무 깊게 끼우지 마십시오. 스테인리스 스틸 나사(M1.6)의 경우 나사를 2-3바퀴 돌리면 뇌에 압력을 가하지 않고 나사를 적절하게 고정할 수 있습니다. 회전 수는 나사의 피치에 따라 다릅니다. Clamp 마이크로 매니퓰레이터의 전극으로 프로브 홀더를 만듭니다(그림 3).
10. AP, ML 및 DV 드라이브 나사를 사용하여 팁이 브레그마에 거의 닿을 때까지 전극과 함께 프로브 홀더를 이동합니다. 브레그마에서 AP, ML 및 DV 버니어 스케일 판독값을 주목하십시오. 판독이 완료되면 전극을 몇 밀리미터 올려 움직이는 동안 전극이 두개골을 긁는 것을 방지합니다. 전극을 구멍에 삽입해야 하는 위치의 좌표를 결정하려면 AP 판독값에 3.6mm를 추가하고 ML 판독값에 2.5mm를 더하기(또는 뺍니다)합니다.
11. AP 및 ML 구동 나사를 사용하여 전극을 계산된 위치로 이동합니다. 이 시점에서 전극 팁은 천공된 전극 구멍 바로 위에 위치해야 합니다. 그런 다음 현미경을 통해 전극을 경막 수준까지 내립니다(그림 4). 이 수준은 DV 방향에서 0 수준으로 사용됩니다. 그런 다음 현미경을 통해 전극 끝을 뇌에 부드럽게 삽입합니다.
12. 전극 핀을 녹음 시스템 커넥터에 연결합니다. 패러데이 케이지를 입체성 기기의 쥐 위에 놓습니다(또는 알루미늄 호일로 대체). 작업 중인 방의 균형으로 입체 기기를 접지합니다.
13. 녹음 시스템을 시작합니다. 가능한 경우 확성기를 사용하여 전극을 전진시키는 동안 단일 장치의 방전/회수에 대한 음향 신호를 얻습니다.
14. 전극을 전진시키면서 전기 활동을 기록하여 전극을 뇌에 천천히 삽입합니다. 경막에서 7.5mm에서 8.1mm 사이의 깊이에서 STN의 특정 전기 활동은 일반적으로 감지할 수 있습니다(그림 6). STN에서 뉴런의 일반적인 활동은 불규칙한 발화 패턴과 높은 발화 속도(평균 주파수: 40.9 ± 12.9Hz)가 특징입니다.
15. 녹음하는 동안, 마취를 가능한 한 많이 줄인다(예: 0.8-1.0%); 마취가 적은 동물은 더 선명한 전기 뇌 활동을 보인다.
16. 전극을 내렸을 때 두개골 표면에서 변위된 혈액이나 뇌척수액을 면봉으로 닦아냅니다.
17. 소량의 치과용 시멘트를 섞어 작은 주걱을 사용하여 전극 주위와 5개의 나사 중 4개 주위에 적용합니다(그림 7). 다섯 번째 나사는 플러그의 접지선을 고정하는 데 사용됩니다.
18. 전극 홀더에서 전극 핀을 분리하고 치과 시멘트가 고정되면 기록 시스템을 연결합니다.
19. 치과 용 시멘트로 고정되지 않은 나사를 풉니 다. 전극 핀에 플러그를 꽂습니다. 플러그의 접지선을 다섯 번째 나사로 고정합니다(그림 8).
20. 치과 용 시멘트를 섞어 플러그 주위에 바르십시오. 시멘트가 두꺼워지면 플러그 주위를 성형하여 캡을 만듭니다. 동물에게 해를 끼칠 수 있는 치과용 시멘트의 날카로운 모서리를 피하고 경화하는 동안 제거하십시오(그림 9A 및 B).
21. 상처 가장자리를 제거하고, 뚜껑 앞뒤를 봉합사로 봉합합니다. 그런 다음 상처 가장자리를 소독합니다.
22. 스위블에 고정된 전선에 헤드 플러그를 연결합니다. 입체 기구에서 쥐를 제거합니다.
23. 중재가 끝날 때 트라마돌(12.5mg/kg, 복강내)을 바르고 2-3일 동안 하루에 한 번 바르십시오. 쥐를 열 지지대가 있는 깨끗한 케이지에 넣고 이 케이지에 스위블을 고정하고(그림 10) 1시간 동안 주의 깊게 검사합니다.
24. 동물이 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오.

결과

그림 1. 입체 기구에 머리를 고정합니다. 쥐는 입체 액면의 이어 바와 가스 마취 마스크에 의해 고정됩니다.

그림 2. 두개골을 드러냅니다. 정중선 절개 후 피부와 골막을 상처 가장자리로 말아 올리고 4개의 클램프를 사용하여 수술 부위에서 멀리 유지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Pt / Ir 전극	주식회사 FHC	UE (UE	주문품: 명세: UEPSEGSECN1M
플러그	GT Labortechnik (아른슈타인/독일)
핀 헤더	디스트렐렉	Tel.: 143-95-324	단열, 90° 1x3 데이터메이트, 타입 M80-8420342
소켓	디스트렐렉	Tel.: 143-95-621	단일열, 직선 2mm 극 No.1x3 DataMate, 유형 M80-8400342
스테인레스 스틸 스프링	플라스틱 ONE	SS0102	부품-#: .120 X .156 스프링 ID(mm): 3.0 스프링 OD(mm): 4.0
치과 용 시멘트 / Paladur	헤레우스 쿨처	64707938	액체, 500ml
치과 용 시멘트 / Paladur	헤레우스 쿨처	64707954	파우더, 로즈, 500g
헤드 스크류	허머 & 레이스	V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP	베토퀴놀		435678/04
메피바카인 1%	아스트라제네카		PZN03338515
에피네프린	사노피-아벤티스		PZN00176118
트라마돌하이드로클로라이드	로텍스메디카		38449.00.00

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