쥐의 횡격장 신경을 자극하여 복합 근육 활동 전위를 측정합니다.

초록

출처: Martin, M. et al. Phrenic Motor Neurons에 의한 횡격막 신경 분포의 기능적 및 형태학적 평가. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오는 횡격막 신경 자극을 통해 쥐의 횡격막 근육 섬유에 복합 근육 활동 전위(CMAP)를 기록하는 방법을 설명합니다. 횡격막 신경의 고강도 전기 펄스 자극은 횡격막 근육 섬유에 활동 전위를 생성하며, 이는 반응 곡선을 얻어 관찰됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물 준비하기:

1. 1-2%의 흡입제(이소플루란)를 사용하여 쥐를 마취하거나 주사(케타민, 자일라진, 아세프로마진)를 투여합니다. 주사 가능한 마취의 복용량은 다음과 같습니다 : 케타민 95.0 mg / kg, 자일라진 10.0 mg / kg, 아세프로 마진 0.075 mg / kg.
   메모: 당사는 이 CMAP 기록 프로토콜을 수행할 때 흡입제 및 주사 가능한 마취 접근법을 모두 선호하지 않고 성공적으로 사용합니다.
2. 동물은 수술이 시작되기 전, 수술이 끝날 때까지, 그리고 수술 후 부프레노르핀이 효과를 발휘할 때까지 적절한 마취 깊이를 유지해야 합니다. 짧은 발가락 꼬집음으로 적절한 마취를 확인하여 금단 반응이 유발되지 않는지 확인합니다. 또한 면봉으로 각막 반사를 테스트하십시오. 수술 과정 전반에 걸쳐 심박수와 호흡수가 증가하지 않았는지 확인하여 마취 깊이가 너무 가벼워졌음을 시사합니다.
3. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 수의사 연고를 바르십시오.
4. 외과의는 수술을 시작하기 전에 소독제(클로르헥시딘 스크럽)로 손을 씻어야 합니다. 외과의는 멸균 장갑, 안면 마스크, 가운 또는 깨끗한 실험실 가운을 착용해야 합니다. 모든 기구는 수술 전에 세척하고 고압증기멸균해야 합니다. 기구 수준에서 고압증기멸균하기 전에 기구 키트 내부에 멸균 표시기 스트립을 추가하여 멸균이 완료되었는지 확인하십시오. 외과의는 수술을 시작하기 전에 스트립의 전체 선이 검은색인지 확인해야 합니다. 상자 외부에도 표시 오토클레이브 테이프를 테이프로 붙입니다. 같은 날 여러 동물에 대한 수술을 수행해야 하는 경우 수술 사이에 기구를 세척하고 유리 구슬 살균기로 살균하십시오. 필요한 경우, 적절한 시간 동안 기구의 손잡이를 살균기에 넣고, 멸균 지혈기로 기구를 제거하고, 멸균 필드에서 냉각한 다음 기구의 기능적 끝을 유리 구슬 살균기에 적절한 시간 동안 넣어 유리 구슬 살균기에서 기구의 양쪽 끝을 살균합니다.
5. 동물이 마취되면 등쪽 표면이 아래를 향하고 복부가 위를 향하도록 하여 테이프를 사용하여 동물의 앞다리를 수술용 보드에 고정할 수 있도록 합니다.
6. 두개골 기저부에서 꼬리 방향으로 복부 표면을 면도하고 기록되는 반횡격막에 따라 정중선 양쪽의 복부 주변 영역이 면도되도록 합니다. 포비돈 요오드를 면도한 피부 표면에 바릅니다.

2. CMAP 녹음 준비:

1. 동물 준비 후 접지 전극을 피하로 꼬리에 놓습니다(그림 1).
2. 기준 전극을 반대쪽 하복부 부위에 피하로 놓습니다.
3. 전도성 젤을 접착 표면 스트립 또는 디스크 기록 전극(표면 스트립 전극 치수: 0.5 x 3cm)에 놓고 표면 전극을 편측 늑골 가장자리를 따라 가로로 놓습니다.
4. 자극 전극을 기관 측면과 쇄골 위쪽으로 0.5cm 간격으로 경피적으로 배치합니다. 전극을 피부를 통해 약 1.0cm 깊이로 삽입합니다. 후속 자극으로 전극의 위치가 움직이지 않도록 전극을 손으로 고정합니다.
   메모: 각도 자극 전극은 삽입 부위의 피부에 대해 90°입니다.

3. CMAP(Compound Muscle Action Potential) 녹음:

1. 자극기/증폭기를 사용하여 전기생리학적 기록을 얻은 후 컴퓨터 지원 데이터 분석을 수행합니다.
2. 단일 풀 자극의 자극 매개변수는 0.5msec, 1.0Hz 초최대 펄스여야 합니다. 자극의 진폭은 6.0V에서 8.0V 사이여야 합니다(그림 2A).
   메모: 실험 내에서 동물 전체에 걸쳐 동일한 진폭을 가진 자극 강도를 사용합니다. 목표는 자극의 최소 진폭을 사용하여 응답 진폭을 최대화하는 것입니다. 자극 시 발생하는 초기 반응은 자극 인공물이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, 자극 아티팩트 이후 안정된/평평한 기준선이 선행되는 CMAP 반응을 얻기 위해 주의를 기울여야 하며, 그 다음에는 빠른 CMAP 반응이 뒤따릅니다. 이러한 반응을 얻기 위해, 자극을 재배치하거나 전극을 기록하는 것이 필요할 수 있다.
3. 자극 사이에 30초 동안 기다렸다가 10회 연속으로 자극을 반복하여 평균 반응을 구합니다(그림 2B-C). 기준선에서 피크까지의 진폭을 측정합니다(그림 2A). 횡격막 신경/횡격막이 활성화되지 않은 동물의 호흡 주기 단계에서 횡격막 신경 자극을 수행합니다. 이 절차는 반대쪽 반쪽 횡격막에 대해 동일한 동물에서 반복할 수 있습니다.
4. 최종 CMAP 기록 세션 후 횡격막 신경근 접합부(NMJ) 염색이 수행되는 경우 동물을 관류합니다. 대략 일주일에 한 번(또는 선택한 간격으로) 동일한 동물에 대해 CMAP 기록을 반복적으로 수행합니다.
5. 생존 CMAP 기록 후 동물이 순환하는 따뜻한 물 가열 패드에서 회복할 수 있도록 하고 회복하는 동안 깨어나 엄숙하게 누울 때까지 지속적으로 모니터링합니다. 수술을 받은 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌려보내지 마십시오.
6. 일단 엄지로 누워 있으면 처음 48시간 동안 12시간마다 동물을 모니터링합니다(그 후에는 하루에 한 번). 동물이 탈수된 것 같으면(피부가 흐물흐물하고 무기력함) 수술 후 체중 및 체액 손실이 안정될 때까지 수액(젖산 링거 용액, 피하, 부위를 회전시킨 상태에서 주사당 1-2ml, 하루 2회)을 투여합니다. 수술 후 급성 기간 동안 동물에게 부드러운 음식을 작은 접시에 담아 먹이고, 필요한 경우 동물이 철망 뚜껑 사료통에 닿지 않는 경우 먹도록 장려합니다.
7. 수술 종료 전에 0.05mg/kg의 용량으로 부프레노르핀을 투여한 다음 처음 24시간 동안(이후 통증/스트레스 징후에 따라 다름) 피하 주사(부위 회전)를 통해 12시간 간격으로 투여합니다. 그 후 통증이나 고통의 징후가 보이면 동물에게 부프레노르핀을 투여하십시오. 통증/고통을 나타내는 징후에는 활동 부족, 발성, 식사 또는 음주 부족(탈수), 과도한 체중 감소, 보호, 절개 부위의 과도한 갉아먹기 또는 긁는 것이 포함됩니다. 통증과 고통을 결정하는 데 사용되는 추가 기준에는 외부 자극에 대한 무반응, 일시적이거나 이유 없는 발성, 노동 또는 비정상적인 호흡, 지속적인 적갈색 비강 안구 분비물, 현저한 필로에렉션이 포함됩니다. 또한 아픈 동물을 암시하는 열악한 위생의 증거를 모니터링하십시오. 치료 후 72시간 후에도 동물이 여전히 고통스러워하는 것이 관찰되는 경우(위의 통증/스트레스 기준에 따라 위에서 설명한 진통제 프로토콜을 받은 후) 동물을 안락사시킵니다.

결과

그림 1: CMAP 전극 배치. 접지 전극은 꼬리에 피하로 배치됩니다. 기준 전극은 복부에 배치됩니다. 표면 기록 전극은 편측 늑골 가장자리를 따라 가로로 배치됩니다. 자극 전극은 빨간색과 검은색으로 표시됩니다.

그림 2: CMAP 기록 및 분석.(A) CMAP 응답의 진폭은 기준선에서 피크까지 측정할 수 있습니다. 일반적인 CMAP 응답은 자극 아티팩트와 반응 곡선을 모두 표시해야 합니다. (BC<...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
작은 봄 가위	정밀 과학 도구	15002-08
해부 겸자	정밀 과학 도구	11295-51
CMAP 기록용 소프트웨어	범위 3.5.6; 안녕
디스크 표면 전극	Natus 신경학	제019-409000
피하 바늘 전극	Natus 신경학	제019-453100
전도성 젤	아쿠아소닉	Tel.: 122-73720
CMAP 녹음을 위한 자극기/녹음 시스템	ADI Powerlab 8SP 자극기
CMAP 녹음용 증폭기	바이오AMP