생체 내 Drosophila melanogaster에서 Synaptically Localized Calcium Sensors를 사용한 칼슘 이미징

초록

출처: Hancock, C. E. et al., Drosophila melanogaster에서 학습 유도 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징.J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 파리에서 시냅스적으로 국소화된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징 방법을 보여줍니다. 현미경 검사를 위해 파리를 준비하고, 후각 조절을 수행하고, 냄새로 인한 칼슘 유입을 시각화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. 형질전환 초파리, Drosophila melanogaster

1. 원하는 Gal4 및 UAS 구조를 각각 운반하는 암컷 처녀 파리와 수컷 파리(12시간 명암 주기에서 60% 상대 습도에서 25°C에서 자름)를 교차시켜 관심 있는 특정 뉴런이 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 발현하는 파리를 생성합니다.
2. 위 교배종의 암컷 자손은 폐쇄 후 3-6일 범위에 있을 때까지 나이를 먹습니다. 암컷 파리는 크기가 약간 더 크기 때문에 선호됩니다.

2. 생체 내 칼슘 이미징을 위한 초파리의 준비

1. 암컷 플라이 한 마리를 선택하고 5분 이상 얼음 위에서 마취합니다.
2. 미세한 집게를 사용하여 파리를 이미징 챔버에 놓습니다(그림 1c 참조). 흉부와 다리가 챔버 바닥의 전선과 접촉하고 머리가 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오. 투명 접착 테이프를 사용하여 파리의 위치를 고정합니다.
   메모: 이 프로토콜은 파리가 고정되어 있고, 머리 캡슐을 열 수 있으며, 파리는 더듬이에 대한 냄새 자극과 흉부와 다리에 대한 전기 충격을 모두 받을 수 있는 맞춤형 챔버가 필요합니다(그림 1).
3. 메스 손잡이에 고정된 수술용 메스 날을 사용하여(재료 표 참조) 파리의 머리 주위 테이프에 있는 창을 잘라 더듬이는 덮고 흉부의 가장 앞쪽 부분만 노출시킵니다.
4. 머리의 측면과 뒤쪽을 오목하고 볼록한 턱으로 고정된 곤충 핀을 사용하여 조심스럽게 조작한 청색광 경화 접착제로 둘러쌉니다. 파란색 발광 LED 램프를 사용하여 접착제를 설정합니다.
5. 접착제가 완전히 굳었는지 확인하고 플라이 헤드의 등 표면에서 경화되지 않은 잔여 접착제를 제거합니다.
6. Ringer's solution(재료 표 참조) 한 방울을 바르고 노출된 머리 큐티클을 덮습니다.
7. 매우 가는 칼날을 사용하여 큐티클을 자릅니다. 큐티클을 가장 효율적으로 제거하려면 먼저 ocelli를 시작점으로 사용하여 머리 뒤쪽을 가로질러 자릅니다. 그런 다음 눈 중앙의 각 측면을 잘라 집게를 사용하여 쉽게 떼어낼 수 있는 큐티클 플랩을 만듭니다.
8. 관심 있는 뇌 영역을 차단할 수 있는 과도한 큐티클을 제거합니다.
9. 뇌 조직 자체가 파괴되지 않도록 미세한 집게를 사용하여 기관의 등 표면을 조심스럽게 청소합니다. 조직 파편 영역을 제거하기 위해 필요에 따라 Ringer의 용액(재료 표 참조)을 제거하고 새로 고칩니다.
10. 피하 냄새 전달 바늘을 파리 머리에서 약 1cm 떨어진 위치에 놓습니다. 안테나로의 냄새 전달을 방해할 수 있는 것이 없는지 확인하십시오.
11. 현미경에서 피하 냄새 전달 바늘을 통해 이미징 챔버를 냄새 전달 시스템에 연결합니다.
12. 파리가 마취와 수술에서 완전히 회복하고 공기 흐름에 적응할 수 있도록 이 단계에서 10분의 휴식 시간을 시행하십시오.

3. 생체 내 칼슘 이미징

1. 적외선 레이저와 침수 대물렌즈(재료 표 참조)가 장착된 다광자 현미경을 진동 차단 테이블에 설치하여 사용합니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 기반 칼슘 지시약의 시각화를 위해 레이저를 920nm의 여기 파장으로 조정하고 GFP 대역 통과 필터를 설치합니다.
2. 거친 Z 조정 손잡이를 사용하여 뇌의 Z축을 스캔하고 관심 있는 뇌 영역을 찾습니다. 자르기 기능을 사용하면 이 영역에만 스캔에 집중하여 스캔 시간을 최소화하고 머리 앞쪽이 아래를 향하도록 스캔 보기를 회전
할 수 있습니다.
3. 프레임 크기를 512 x 512픽셀로, 스캔 속도를 > 4Hz로, 스캔 영역(Y 차원)을 조정하여 관심 있는 뉴런이 덮이도록 합니다.

4. 후각 조건화를 통한 냄새 유발 칼슘 과도 현상의 시각화

1. 시간적으로 정확한 방식으로 여러 냄새 자극을 전달할 수 있는 냄새 전달 시스템을 사용하십시오.
   1. 추가 컴퓨터를 사용하여 장치를 제어하고 이미징 현미경 소프트웨어와 통신하여 실험 중 이미지 캡처와 냄새 자극을 조정합니다.
   2. 별도의 프로그램에서 냄새 전달 프로토콜의 시작에 의해 제공되는 외부 입력 트리거에 응답하는 이미지 획득 소프트웨어와 냄새 전달 프로그램(예: 현미경 제어 소프트웨어에 설치된 VBA 매크로 패키지, 재료 표 참조)을 연결할 수 있는 사전 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작합니다.
2. 512 x 512 px의 해상도와 4Hz의 프레임 속도에서 "사전 교육"/순진한 냄새 유발 칼슘 과도 현상을 모니터링하여 측정을 시작합니다. 냄새 시작 전 6.25초(F₀ 기준선 값 설정 위해) 및 냄새 상쇄 후 12.5초 동안 추가 이미지 획득으로 2.5초의 냄새 자극을 제공합니다. 두 번째 냄새 맡는 제로, 세 번째 취하기로 이 과정을 반복하십시오.
3. 이 측정 후 3분 동안 플라이에 대한 고전적 조건화("훈련")를 계속합니다.
   1. "사전 훈련" 단계에서 제시된 냄새 중 하나를 선택하여 조건화된 자극(CS⁺) 냄새가 되고 다른 하나를 선택하여 CS^- 냄새가 됩니다. 12개의 90V 전기 충격과 함께 60초 동안 컴퓨터 제어 냄새 전달 시스템을 사용하여 CS⁺ 냄새를 표시합니다.
   2. 60초 휴식 후 60초 동안 CS^- 냄새만 나타냅니다. 4-메틸시클로헥산올 및 3-옥탄올 냄새로 사용합니다. 세 번째 냄새 물질(예: 1-octen-3-ol)은 교육 단계 전(4.2단계)과 이후(4.4단계)에만 대조군으로 사용되므로 이 교육 중에는 제시하지 마십시오.
4. 훈련 단계(4.3단계)를 마치고 3분 후에 "훈련 전" 냄새 자극 프로토콜(4.2단계)을 반복하여 "훈련 후" 냄새가 유발하는 칼슘 과도 현상을 다시 측정합니다.
   메모: 이 단계의 타이밍은 기억 형성 후 관심 시간을 반영해야 합니다(예: 단기 기억을 조사하기 위해 조건화 단계 3-4분 후에 이 단계 수행). 일반적으로 파리는 이 준비에서 몇 시간 동안 생존할 수 있습니다.
5. 나중에 이미지 분석을 위해 이미징 파일을 적절한 형식(예: Tiff)으로 저장합니다.

5. 이미지 분석

1. 이미지를 분석하려면 Fiji와 같은 이미지 분석 소프트웨어에서 Tiff(또는 유사한) 파일을 엽니다.
2. X 및 Y 방향의 움직임을 최소화하기 위해 이동 보정 알고리즘을 사용하여 스택을 정렬합니다. Z축에서 강한 움직임을 보이는 모든 녹음을 삭제합니다.
3. 검사할 영역 주위에 관심 영역(ROI)을 표시하는 데 사용되는 소프트웨어 도구를 선택합니다. 이는 배경 형광의 영향을 제한하기 위해 가능한 한 정확해야 합니다.
4. 해당 소프트웨어 도구를 사용하여 선택한 ROI에서 시간 형광 강도 데이터를 데이터 파일로 추출하여 기록의 각 프레임에 대한 값이 생성되도록 합니다.
5. 데이터 분석 프로그램을 사용하여 데이터를 열어 각 냄새 추적에 대한 ΔF/F₀ 값을 계산합니다. F₀ = 냄새가 나기 전 2초 동안의 평균 형광. ΔF = 주어진 프레임의 원시 형광과 F₀의 차이. 이러한 값에서 각 프레임에 대한 ΔF/F₀ 값을 계산하며, 이는 냄새 자극 기간 동안 상대 형광을 반영하기 위해 시간에 대해 표시할 수 있습니다.

결과

그림 1: 마운팅 챔버의 구성 및 이미징을 위한 플라이 준비.(a) 플라이 장착 챔버의 건설 단계. 바닥은 미세한 플라스틱 메쉬(2)로 덮인 표준 현미경 슬라이드(1)로 형성됩니다. 반대 전하(3)를 전달하는 두 개의 전선이 양쪽의 슬라이드에 접착됩니다. 와이어는 서로 평행하지만 접촉하지 않는 슬라이드(4)를 가로지르기 위해 벗겨지고 구부러집니다. 투명 접착 테이프 층(5)을 플라이 높이(약 1mm)에 도달할 때까지 추가합니다. 채널은 파리의 너비에 맞게 약 1mm 너비의 테이프를 수직으로 (6) 절단합니다. 투명 접착 테이프(7)로 만든 고가 플랫폼이 전선 바로 위에 만들어져 파리의 머리를 위한 베개를 형성하고 흉부는 전선 위에 있습니다. (b) 이광자 현미...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 옥텐 3 ol	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	O5284	냄새 물질로 사용되는 화학 물질
3-옥탄올	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	218405	냄새 물질로 사용되는 화학 물질
4-메틸시클로헥산올	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	153095	냄새 물질로 사용되는 화학 물질
EGFP용 대역통과 필터(525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, 독일 예나
투명 점착 테이프	Tesa SE, 독일 노르더슈테트		표준 투명 접착 테이프
오목-볼록 죠	Fine Science Tools, 노스 밴쿠버, 캐나다	10053-09	오목-볼록한 죠가 있는 블레이드 홀더
가는 집게	Fine Science Tools, 노스 밴쿠버, 캐나다	11412-11	팁이 있는 집게 0.1 x 0.06mm
피하 주사 바늘	Sterican - B. Braun, Melsungenk, 독일	4665120	1.20x40mm
곤충 Minutien 핀	Fine Science Tools, 노스 밴쿠버, 캐나다	26002-10	지름 0.1mm, 팁 0.0125mm
켄토플로우	Kent Express Dental Supplies, 질링엄, 영국	953683	블루 라이트 경화 접착제
현미경 슬라이드	Carl Roth GmbH & Co. KG, 카를스루에, 독일	656.1	표준 대물렌즈 슬라이드 76 x 26mm
미네랄 오일	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	M8410	부취제의 희석제로 사용
모드 잠금 Ti-사파이어 레이저 카멜레온 비전 2	Coherent Inc., 미국 캘리포니아주 산타클라라		조정 가능한 적외선 펨토초 레이저
BiG 검출기가 장착된 다광자 현미경 LSM 7MP	Carl Zeiss Microscopy GmbH, 독일 예나		다광자 현미경, 여러 회사에서 유사한 장치를 제공합니다.
Plan-Apochromat 20x(NA = 1.0) 수침 대물렌즈	Carl Zeiss Microscopy GmbH, 독일 예나	421452-9900-000	대물렌즈 W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer의 솔루션	북미	북미	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM 자당, pH = 7.4
찌르는 칼	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, 미국 펜실베니아 주 레딩	72-1551	5.0mm 스트레이트 제한 블레이드 깊이
수술용 메스 블레이드	Swann-Morton, 셰필드, 영국	303	상품 번호 11
외과용 메스 손잡이	Swann-Morton, 셰필드, 영국	907	제품 번호 7S/S
VBA(Visual Basics of Applicatons) 소프트웨어는 냄새 전달 장치와 전기 충격 응용 장치(전원 공급 장치)에서 트리거를 수신하여 현미경을 제어하는 Zeiss의 ZEN 소프트웨어와 상호 작용합니다.	주문 제작되고 요청시 이용 가능	북미	북미

년 년 년 년 의 의