Microelectrode Array System을 이용한 초음파 유도 신경조절

Abstract

출처: Liang, R. et al., Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-well Microelectrode Arrays. J. Vis. 특급 (2024)

이 비디오는 집속 초음파 변환기를 사용하여 다중 웰 미세 전극 어레이 또는 MEA 시스템에서 배양된 인간 iPSC 유래 뉴런에서 신경 활동의 조절을 유도하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

1. 재료 준비

1. 배양 배지를 흡입하고 이를 사용하여 미세 전극 어레이(MEA)가 내장된 24웰 뉴런 배양 플레이트의 단일 웰을 채웁니다(그림 1A).
2. 파라필름 인터페이스, 고무 밴드 및 고무 멤브레인이 있는 집속 초음파(FUS) 콘을 70% 에탄올을 사용하여 10분 동안 살균하고 나중에 조립할 수 있도록 흄 후드에 넣습니다.
3. 300mL의 탈이온수와 50mL의 커플링 젤을 탈기합니다. 물과 겔을 160 x g에서 5분 동안 원심분리하여 커플링 매체 내에서 캐비테이션이 발생하지 않도록 합니다.
   메모: 인간 유도 만능 줄기 세포(HiPSC)의 원래 출처는 GM01582 및 CIPS 세포주에서 추출합니다. 평균적으로 웰당 5 x 10⁴ 운동 뉴런과 2.5 x 10⁴ 성상세포의 밀도를 달성할 수 있습니다.

2. 주변 장치의 연결 및 설정

1. 나사를 사용하여 FUS 콘을 변환기에 고정하고 통풍이 잘되는 멸균 후드에 유연한 고무 멤브레인으로 콘을 밀봉합니다. 1.3단계의 탈기 및 탈이온수(DG-DI)로 원뿔을 채우고 캐비테이션을 방지하기 위해 원뿔에 기포가 없는지 확인합니다.
2. 맞춤형 나사산 막대를 사용하여 3D 프린팅 홀더를 프레임에 고정합니다(그림 1B). FUS 변환기의 머리가 자극될 우물 위에 오도록 프레임을 배치합니다.
3. 고무 밴드를 사용하여 배지와 HiPSC를 포함하는 24웰 MEA 플레이트의 웰 위에 파라필름을 고정합니다.
4. 초음파 변환기의 백엔드 드라이버 전자 장치(이 경우 변환기 전원 출력(TPO))를 100-240V 전원 콘센트에 연결하고 일치하는 네트워크를 TPO 및 FUS 변환기에 연결하여 FUS 시스템을 준비합니다. 매칭 네트워크는 트랜스듀서와 TPO 간의 효율적인 전기적 결합을 보장합니다.
5. MEA 시스템을 전원 콘센트(100-240V)에 연결합니다(그림 2B, 연결 5). MEA 시스템 동기화 포트를 TPO에 연결합니다(그림 2B, 연결 3). 이 연결은 MEA 시스템의 데이터 수집을 FUS 시뮬레이션과 동기화합니다.
6. MEA 시스템에 24웰 MEA 플레이트를 놓고 뚜껑을 제거하여 트랜스듀서와 웰이 직접 접촉할 수 있도록 합니다. 3.2단계(그림 2A 및 그림 1B)에 설명된 대로 탈기된 커플링 젤을 위한 공간을 확보하기 위해 트랜스듀서를 웰 플레이트에서 5-10mm 위로 놓습니다.

3. 자극 및 신경 신호 획득

1. TPO 제어판에서 FUS 매개변수를 설정합니다(표 1).
2. 파라필름 위에 커플링 젤을 바르고 FUS 트랜스듀서를 커플링 젤 안으로 내려 기포를 최소화하면서 젤과 접촉하도록 합니다(그림 1A).
3. 사용자 인터페이스에서 시작 버튼을 클릭하여 MEA 시스템 기록을 시작합니다.
4. TPO의 오른쪽 하단 버튼을 눌러 FUS 초음파 처리를 시작하고(그림 2A, 라벨 7), 뉴런이 기준선 상태로 돌아갈 수 있도록 각 초음파 처리 라운드 사이에 최소 5분을 기다립니다.
5. FUS 시스템에서 생성된 트리거 펄스를 사용하여 FUS 자극 시퀀스를 MEA 기록에 정렬합니다(그림 1B, 연결 3).

표 1: TPO에 설정된 집속 초음파(FUS) 매개변수

매개 변수	값
최대 출력/채널	1.200 와트
팩추얼	0.749W/채널
ISPPA (이스파)	10.79 승 / cm2
이스타(ISPTA)	0.05 승/센티미터2
버스트 길이	0.100 밀리세컨드
빈도	250.00 킬로헤르츠
초점	39.800 밀리미터
마침표	20.000 밀리세컨드
타이머	60.000 초

Results

그림 1: 다중 웰 미세전극 어레이(MEA)를 사용한 FUS 신경조절. (A) 다중 웰 MEA를 사용한 FUS 신경 조절 설정의 개략도. FUS 트랜스듀서에 의해 생성된 음파는 탈기된 물로 채워진 FUS 원뿔을 통해 전파되고 초음파 젤을 사용하여 결합됩니다. 파라 필름은 오염을 방지하기 위해 고무 밴드를 사용하여 우물에 고정됩니다. MEA 플레이트는 뉴런에서 MEA 시스템으로 전기 기록을 보냅니다. (B) MEA 시스템에 포함된 멀티웰 플레이트의 FUS 트랜스듀서 사진.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEA 시스템	액시온 바이오시스템(Axion Biosystem Inc.)	마에스트로 엣지	샘플링 속도: 11500 Hz
MEA 플레이트	액시온 바이오시스템(Axion Biosystem Inc.)	사이토뷰 MEA	전극과 우물: 24의 우물에 있는 16의 전극
웰 플레이트 인터페이스	Amcor 주식 회사	파라필름 PM996; P7793	두께: 127 μm
배양을 위한 CO2 탱크 및 조절기	에어가스 주식회사/ 해리스 주식회사	9296NC	농도 : 5 %
문화 미디어	써모피셔 Inc.	라미닌; 23017-015	농도 : 1 μg / mL
HiPSC 뉴런	페프로텍	CIPS 및 GM01582 파생; 450-10	농도: 10ng/mL(Taga et al [2021]13 참조)
변환기	소닉 컨셉 Inc.	CTX250; 008	중심 주파수: 250kHz
매칭 네트워크	소닉 컨셉 Inc.	CTX250; NFS102v2	임피던스 : 50 Ω
트랜스듀서 전력 출력(TPO)	소닉 컨셉 Inc.	버전 4.1; 020	주파수: 250kHz에서 2.5MHz까지
양피지	맥마스터 주식회사	실리콘 고무; 5542N115	두께: 0.0127 cm
커플 링 젤	파커 연구소 Inc.	아쿠아소닉 100; B08DDWG GXB	점도: 130,000–185,000 cops
프로브 홀더에 연결	맥마스터 주식회사	실을 꿴 막대를 훔치십시오; 90322A661	길이 : 1–1/2 " 길이
수중청음기	소닉 컨셉 Inc.	Y-104; 009	범위: 50kHz–1.9MHz
수조	소닉 컨셉 Inc.	무게	크기: 30cm x 30cm x 30cm
물 조절 장치	소닉 컨셉 Inc.	WCU; SN006	유속: 최대 50 mL/s
오실로스코프	로데슈바르즈 Inc.	RTC1002	샘플링 속도: 최대 50MHz
무대	소닉 컨셉 Inc.	마이크로스테이지; 2	정확도 : 1 μm
감온 시트	주식회사 TIPTEMP	액정 시트; TLCSEN337	범위: 22–24 °C
컴퓨터	Microsoft Surface	Surface Pro	CPU i5 1035G4: 3.7GHz
데이터 전송 소프트웨어	매스웍스 Inc.	MATLAB을	버전 2021b
프로세싱 소프트웨어	Python 소프트웨어 재단	파이썬	버전 3.7.10