1. 녹음 전 설정
- 표 1에 표시된 대로 이온 농도를 가진 기록 용액을 준비합니다.
- MgCl2, CaCl2, KCl 및 CsCl에 대한 초순수에 2M 원액 15mL를 준비합니다.
- 표 1에 따라 세포 내 완충 용액 100mL와 세포 외 완충 용액 500mL에 대한 고체 성분을 별도의 비커에 칭량하고 나중에 준비된 원액을 각각 추가합니다. 예를 들어, 세포 내 완충액의 경우 0.3803g(10mM) EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산), 0.2383g(10mM) HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산) 및 0.6428g(110mM) NaCl을 사용하고 100μL의 2M MgCl 2 및 CaCl2와 50μL의 2M KCl 및 CsCl 원액을 추가합니다.
- 초순수를 첨가하고 측정을 방해하지 않는 산과 염기를 사용하여 pH를 조심스럽게 조정하십시오. 이는 구연산 및 N-메틸-D-글루카민(NMG+)과 같이 ChR(Channelrhodopsins)에 의해 수행되지 않습니다.
- 세포 내 삼투압을 세포 내 삼투압의 경우 290mOsm으로 조정하고 포도당이 있는 세포 외 용액의 경우 320mOsm으로 조정합니다.
메모: 약간 저삼투압적인 세포 내 용액은 패치 성공률을 높입니다.
- 멸균 필터는 0.22μm 필터를 통해 모든 용액을 필터링합니다. 용액을 4°C에서 2주 동안 보관하거나 -20°C에서 동결하여 장기간 보관하십시오.
- 액체 접합 전위를 계산하고 기록 프로토콜을 준비합니다.
참고: 전체 세포 구성을 확립한 후 세포 외 염화물 농도의 변화는 수정해야 하는 상당한 액체 접합 전위(LJP)를 유발합니다. LJP는 직접 측정하거나 계산할 수 있으며, 여기서는 후자의 옵션이 사용됩니다. 이 프로토콜에서는 온라인 보정이 사용되며 각 외부 버퍼에 대해 하나의 녹음 프로토콜이 필요합니다. 그러나 더 큰 외부 솔루션 집합의 경우 잘못된 수정을 방지하기 위해 LJP의 사후 수정을 사용하는 것이 좋습니다.
- 접합 전위 계산기(JPC)를 열고 '새 실험' 대화 상자를 엽니다. 그런 다음 "Patch-clamp measurements"를 선택합니다. "whole-cell measurements" 및 "Standard salt-solution electrode"를 선택하고 25°C의 온도를 입력합니다. 각 단계 사이에 "다음" 버튼을 눌러 선택을 수락하여 계속 진행합니다.
참고: 실험은 에어컨이 설치된 실험실에서 25°C의 실온에서 수행됩니다. 실험을 시작하기 전에 버퍼 용액이 실온인지 확인하십시오. 시료 온도를 변경하기 위해 배양 단계 또는 챔버를 사용할 수 있습니다. 수조 온도는 온도계로 자주 측정할 수 있습니다.
- 피펫 용액의 모든 개별 음이온 및 양이온 농도와 고 염화물 완충액을 표 1.
에 나열된 농도에 따라 추가합니다.
메모: JPC는 시작 조건에 대해 -0.5mV의 LJP를 계산합니다.
- "New Bath Solution"을 클릭하여 저염화물 완충액의 음이온 및 양이온 조성을 입력합니다.
메모: JPC는 이제 변경된 세포외 기록 솔루션에 따라 +12.6mV의 새로운 LJP를 계산합니다.
- 적용된 유지 전위에서 계산된 LJP를 빼서 두 측정 조건에 대해 두 개의 LJP 보정 프로토콜을 준비합니다.높은 용액의 경우 -0.5mV, 저염화물 외부 용액의 경우 +12.6mV. 따라서 프로토콜은 각각 -79.5 mV(높은 염화물) 및 -92.6 mV(낮은 염화물)로 시작하여 두 경우 모두 -80 mV의 LJP 보정 시작 유지 전위를 얻습니다.
메모: 다음 단계는 재료 목록에 언급된 데이터 수집 소프트웨어에 적용됩니다.
- 수집 소프트웨어에서 프로토콜 편집기를 엽니다. "모드" 메뉴에서 "일시적 자극"을 선택하고 7개의 스윕을 포함합니다.
- 편집기에서 "파형" 메뉴로 전환하고 0mV 유지 전위가 있는 200ms 주기와 높은 염화물의 경우 -79.5mV에서 시작하는 다양한 유지 전위가 있는 2초 주기를 포함합니다. 두 번째 기간 동안 20mV의 "델타 레벨"을 포함하여 각 스윕에서 유지 전위를 20mV씩 증가시킵니다.
- 파형 편집기의 전압 단계 내에서 540nm 광(3.10mW/mm²)으로 500ms 주기의 조명을 적용합니다. 이렇게 하려면 위에서 설명한 두 번째 기간 이후 500ms 후에 광원이 활성화되도록 제어하는 연결된 셔터의 "디지털 비트 패턴"을 변경합니다(1.2.6 참조).
메모: 빛의 강도는 진폭 또는 불활성화와 같은 채널 전류의 생물물리학적 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 가벼운 전력 밀도는 항상 보고해야 합니다. 모든 광학 장치와 커버슬립을 통과한 후 빛의 힘을 측정하려면 보정된 광량계를 사용하십시오. 전력 밀도를 계산하려면 물체 마이크로미터로 대물렌즈의 조명 필드를 결정하고 측정된 조명 전력을 결정된 조명 필드로 나눕니다.
- 고염화물 세포외 용액에 대한 프로토콜을 저장합니다. 프로토콜을 수정하고 첫 번째 레벨 유지 전위를 -92.6mV(낮은 외부 염화물)로 교체합니다. 이 두 번째 프로토콜을 저장하여 저염화물 세포 외 상태를 측정합니다.
- 적응된 프로토콜에 따른 유리 커버슬립의 라이신 코팅.
- 유리 페트리 접시에 100개의 커버 슬립을 여러 개 놓고 250mL HCl(1N)을 추가합니다.
- 덮개 슬립이 있는 페트리 접시를 선형 셰이커에 놓습니다. 120rpm으로 72시간 동안 흔들어 커버슬립을 청소한 후 초순수로 헹구어 pH를 중화합니다.
- 추가 세척을 위해 소량의 95% 에탄올에 담그십시오.
알림: 깨끗한 커버 슬립은 진행하기 전에 70% 에탄올에 보관할 수 있습니다. 다음 단계를 위해 층류 후드 아래에서 작업하십시오.
- 분젠 버너와 핀셋을 사용하여 각 커버슬립에 불을 붙이고 새 페트리 접시에 옮깁니다.
- 150rpm의 선형 쉐이커로 진탕하면서 실온에서 최소 1시간(또는 밤새) 동안 멸균 50μg/mL 폴리-D-라이신 용액으로 유리 커버슬립을 배양합니다.
- 커버슬립을 초순수로 세척하여 과도한 폴리-D-라이신을 제거합니다.
- 멸균 종이에 커버 슬립을 펴서 10분 동안 건조시키고 UV(자외선)광에 노출시켜 살균합니다(최소 20분).
- 사용할 때까지 알루미늄 호일로 덮인 멸균 페트리 접시에 커버 슬립을 모으십시오.
- 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 mCherry에 융합된 PsACR1 유전자의 DNA를 준비합니다.
- 제한 효소 또는 기타 확립된 클로닝 방법을 사용하여 mCherry 형광단과 함께 프레임에서 PsACR1을 인코딩하는 인간 코돈에 최적화된 유전자 염기서열을 peGFP-C1 플라스미드(CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터, 카나마이신 내성)로 복제합니다.
참고: 다른 형광단도 사용할 수 있지만 설정에서 현미경으로 형광을 관찰할 수 있도록 해당 필터 세트를 사용할 수 있는지 확인하십시오.
- 표준 프로토콜에 따라 열 충격을 통해 플라스미드 DNA를 화학적질성 XL1Blue E. coli 세포로 변환하고 한천 플레이트(30 μg/mL kanamycin)에 플레이트합니다. 도금된 박테리아를 37°C에서 밤새 성장시킵니다.
- 다음날, 30μg/mL 카나마이신이 보충된 4mL의 용해성 배지를 단일 콜로니의 세포에 접종하고 인큐베이터에서 37°C 및 180rpm으로 밤새 배양합니다.
- 하룻밤 배양 후, 제조업체의 지침에 따라 시판되는 키트를 사용하여 배양물에서 플라스미드 DNA를 정제합니다.
- 세포를 씨를 뿌립니다
알림: 층류 후드 아래에서 단계를 수행합니다.
- 35mm 페트리 접시에 최대 3개의 라이신 코팅 유리 커버슬립을 나란히 놓습니다.
메모: 서로 미끄러지지 않도록 접시 바닥에 부드럽게 누르십시오.
- 2mL 표준 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 1.5 x 10 5 HEK(인간 배아 신장 세포) 세포를 파종하고 각 접시에 10% 소 태아 혈청(FBS)을 보충합니다.
- all-trans retinal을 최종 농도 1μM로 보충합니다. 1.6단계를 진행하기 전에 최소 하루 동안 세포를 성장시킵니다.
- lipofection을 통해 세포를 일시적으로 transfection합니다.
- 각 세포 접시에 대해 FBS가 없는 250μL DMEM과 6μL 형질주입 시약이 없는 2μg의 플라스미드 DNA(디옥시리보핵산) 용액을 준비합니다.
- 배양 15분 후, 용액을 세포에 부드럽게(적게) 첨가합니다.
- 한천 다리 준비
- 50mL 멸균 염화나트륨 용액(140mM)에 0.75g의 아가로스를 넣고 전자레인지에서 가열하여 용해합니다.
참고: 한천 브릿지 준비를 위한 2 - 3 M KCl은 더 높은 농도(예: 브릿지로부터의 일정한 확산)와 K+ 및 Cl- 이온의 동등한 이동성으로 인해 LJP를 더욱 감소시키지만, 수조 용액으로의 이온(특히 Cl-) 누출을 최소화하기 위해 피했습니다.
- 주사기를 사용하여 10μL 피펫 팁(또는 작은 직경의 호스)에 액체 아가로스 용액을 채웁니다.
메모: 다리의 기포를 피하십시오.
- 한천 브리지를 냉각하고 응고시킨 후 멸균 140mM 염화나트륨 용액에 보관하십시오.
- 녹음 및 목욕 전극을 준비합니다.
- 패치-CL의 욕조와 녹음 전극에서 은선을 제거합니다.amp 설정.
- 이전 실험에서 염화은을 제거하기 위해 사포로 와이어를 연마합니다. 깨끗한 은선을 3M KCl에 담그고 염화은으로 전해 코팅을 위해 1.5V 배터리의 양극에 연결합니다.
참고: 배터리 대신 연구실 전원 공급 장치를 사용할 수 있습니다.
- 마이크로피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관에서 저저항 패치 피펫(1.5-3.0 MΩ)을 당겨 내고 화염 연마합니다. 측정 당일에는 피펫에 먼지가 없는 곳에 보관하십시오.
- 모든 설정 구성 요소를 켜서 녹음하기 30분 전에 작동 온도까지 가열합니다. 버퍼가 실온에 있는지 확인합니다.
2. 선택도 측정
- 세포의 일시적 형질주입 후 24-48시간 후에 기록을 시작합니다.
- 측정 챔버에 커버슬립 하나를 놓고 실리콘으로 밀봉하여 외부 버퍼의 누출을 방지합니다. 다음 실험 세트를 위해 다른 커버슬립과 함께 페트리 접시를 인큐베이터에 보관하십시오.
- 세포가 분리되지 않도록 챔버를 세포 외 완충액(높음 [Cl-])으로 조심스럽게 채운 다음 현미경 아래에 놓고 40X 대물렌즈를 사용하여 세포를 시각화합니다.
- 수조 전극 위에 한천 브리지를 놓고 유체 레벨 센서 및 수조 처리기의 관류 배출구와 함께 챔버에 놓습니다.
- 세포외 용액을 1mL의 새로운 외부 용액(높음[Cl-])으로 두 번 교환하여 잔류 배양 배지와 분리된 세포를 제거합니다.
- 세포에 초점을 맞추고 다른 세포에서 분리해야 하는 형질주입된(형광) 세포를 검색합니다. 삼중 대역 필터 세트와 주황색 조명(590nm, 대역폭 15nm, 100% 강도)을 사용하여 mCherry.
여기시키고 시각화합니다.
메모: HEK 셀은 갭 연접을 통해 이웃 세포에 전기적으로 결합될 수 있어 전체 셀 구성에서 멤브레인 저항이 낮습니다.
- 당겨진 피펫 중 하나에 세포 내 용액을 채우고 피펫을 여러 번 뒤집어 기포를 제거합니다.
- 피펫을 피펫 홀더에 장착하고 팁이 막히지 않도록 약간의 양압을 가합니다.
- 현미경 아래에서 패치 피펫의 끝을 찾아 micromanipulator.
를 사용하여 세포 가까이로 이동합니다.
메모: 다음 단계는 재료 목록에 언급된 증폭기, 데이터 수집 및 평가 소프트웨어에 적용됩니다.
- 데이터 수집 소프트웨어에서 "멤브레인 테스트"를 시작하고 전압 단계(테스트 펄스; 예: 10ms 동안 5mV, 0mV에서 기준선), 데이터 수집 소프트웨어에서 "멤브레인 테스트"를 실행하는 동안 "배스 모드"를 사용하여 지정된 소프트웨어를 통해 수동 또는 자동으로.
- 피펫 저항이 원하는 범위(1.5-3.0 MΩ)에 있는지 확인하십시오.
- "멤브레인 테스트"의 "수조 모드"에서 작업하는 동안 증폭기에서 피펫 오프셋 손잡이를 돌려 피펫 전위를 조정하여 제로 오프셋 전류.
- 전체 셀 구성에서 패치를 설정합니다.
참고: 다음 단계에서는 사용된 피펫 홀더의 측면 포트로 전달되는 양압 및 음압을 적용해야 합니다. 이는 주사기, 마우스 피스 또는 전자 제어 압력 조절기를 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 마우스 피스를 통해 양압과 음압이 적용됩니다.
- 위에서 패치 피펫으로 세포에 천천히 접근하고 만지기 직전에 양압을 해제합니다.
알림: 팁이 셀에 가까우면 저항이 약간 상승합니다. 이는 테스트 펄스의 크기가 감소한 것으로 표시됩니다.
- "멤브레인 테스트"를 "목욕 모드"에서 "패치 모드"로 변경하여 유지 전위를 세포의 예상 휴지 전위(-30 - -40mV)로 변경합니다.
- 어떤 경우에는 셀 부착 구성이 양압이 해제된 후 자체적으로 형성됩니다. 그렇지 않은 경우 기가씰이 형성될 수 있도록 음압을 부드럽게 가합니다.
메모: 셀 부착 구성은 테스트 펄스가 펄스의 시작과 끝에서 두 개의 작은 용량성 피크로 감소하고 멤브레인 저항이 GΩ 범위에 있을 때 설정됩니다. 최대 -60mV의 음의 전압은 기가씰 형성을 촉진할 수 있습니다.
- "피펫 커패시턴스 보상" 손잡이를 돌려 피펫 커패시턴스를 보상하여 테스트 펄스의 평평한 응답을 얻습니다.
- 음압 또는 음압의 짧은 펄스를 강도가 증가함에 따라 적용하여 씰을 손상시키지 않고 패치를 파열하여 전체 세포 형태를 얻을 수 있습니다.
메모: 세포 부착에서 전체 세포 구성으로의 성공적인 전환은 용량성 피크의 증가로 표시됩니다.
- 멤브레인 전위를 원하는 유지 전압으로 정확하게 클램핑하기 위해 사용된 증폭기의 전체 셀 매개변수 및 보상 조정을 설정하여 직렬 저항 보상을 적용합니다.
- "멤브레인 테스트"를 "전체 셀" 모드로 전환하고, "직렬 저항 보상" 패널에서 "예측" 및 "보정"을 최대 90%까지 켜고, 오버샷 및 용량 성 응답의 진동을 방지하고, 전체 셀 보상 스위치를 켜고, 증폭기의 적절한 전면 패널 노브("전체 셀 용량" 및 "직렬 저항")를 사용하여 전체 셀 매개변수를 반복적으로 조정하여 이상적으로 얻을 수 있습니다. 플랫 테스트 씰 응답.
메모: 직렬 저항 보상 및 보정에 대한 자세한 설명은 증폭기 설명서 또는 지침을 참조하십시오. 이 절차는 제조업체마다 다르므로 이 지침을 참조하십시오.
- 전체 세포 구성을 설정한 후 패치 피펫을 통해 세포 내 용액을 충분히 교체할 수 있도록 기록하기 전에 최소 2분을 기다립니다.
- 이전에 설정된 프로토콜(1.2)을 사용하여 서로 다른 유지 전위에서 광 유도 전류를 기록합니다.
- 패치를 파괴하지 않고 챔버에서 세포외 완충액을 최소 5회 이상 낮은 [Cl-]로 교환하고 새로운 염화물 농도에서 다른 전류-전압 관계(1.2단계 참조)를 기록합니다.
메모: 자동 버퍼 교환을 위한 관류 시스템은 이 프로세스를 용이하게 하지만 반드시 필요한 것은 아닙니다.
- 테스트할 모든 이온 상태에 대해 2.15를 반복하되 위에서 설명한 "멤브레인 테스트"를 통해 측정 사이에 패치의 품질을 반복적으로 확인합니다.
메모: 정확한 멤브레인 전압과 안정적인 세포 내 이온 구성을 보장하려면 멤브레인 저항이 500MΩ 이상이어야 하는 반면 액세스 저항은 10MΩ을 초과해서는 안 됩니다(2.12.6). 멤브레인 테스트를 위해 전체 세포 매개변수 보상을 끄는 것을 잊지 마십시오.
- 여러 세포에 대해 2.2.에서 2.15.까지 반복하되 세포의 건강을 보장하기 위해 각 테스트 시리즈에 대해 새로운 커버 슬립을 취합니다.
표 1: 버퍼링된 용액의 이온 조성. HEK 세포의 염화물 선택성 실험을 위한 세포 내(내) 및 세포 외(추가) 완충액의 구성. 사용 된 약어 : 에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA), 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 및 아스파르트 테이트 (ASP). 모든 농도는 mM 단위입니다.
의
의
의
개
개
개
표시기
개
개
개
개
개
개
개
개
개
분
분
분
분
| 내부. | 엑스트라.1 | 엑스트라.2 |
| 높은 염화물 | 저염화물 | 저염화물 |
| 씨 [mM] | 씨 [mM] | 씨 [mM] |
| 나-ASP | 0 | 0 | 140 |
| 염화나트륨 | 110 | 140 | 0 |
| 케이클 | 1 | 1 | 1 |
| 증권 시세 | 1 | 1 | 1 |
| 염화칼슘2 | 2 | 2 | 2 |
| 재질 보기 MgCl2 | 2 | 2 | 2 |
| 헤페스 | 10 | 10 | 10 |
| 에그타 | 10 | 0 | 0 |
| 산도 | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| 삼투압 | 290 미터Osm | 320 미터오름 | 320 미터오름 |