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1. 녹음
참고: 이 절차에서, 고립된 신경절의 패치 클램프 기록은 일반적으로 도금 후 12-24시간 후에 수행됩니다. 다른 실험실에서는 배양에서 훨씬 더 오랜 기간 후에 뉴런의 결과를 보고했습니다.
- 녹음실 준비
- 배양 접시에서 직접 패치 클램프 녹음을 허용하는 빠른 교환 기록 챔버(또는 이와 동등한 것)를 사용하십시오. 도립 현미경에 챔버를 설정합니다.
- 유리 바닥 배양 접시를 챔버에 삽입합니다.
- 관류 튜빙 시스템을 통해 L-15 용액을 기록 챔버에 공급합니다. 챔버 내 유입 및 유출 관류를 분당 0.5-1mL의 속도로 안정화합니다.
- 전극 적재를 위한 내부 용액을 준비합니다.
- perforated-patch 내부 용액의 부분 표본을 해동합니다. 35mm 배양 접시에 2.5mL의 용액을 할당합니다. 배양 접시의 뚜껑을 교체하고 "Tip Dip"으로 표시합니다. 이 솔루션을 가능한 한 깨끗하게 유지하는 것이 매우 중요하므로 먼지가 없는 구역에 보관하십시오.
- 암포테리신-B 1mg의 무게를 측정하고 20μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가합니다. 모든 암포테리신-B가 용액에 들어갈 때까지 용액을 소용돌이치고 스핀다운합니다. DMSO/암포테리신-B 용액 10μL를 해동된 천공 패치 내부 용액의 나머지 2mL에 추가합니다. DMSO/암포테리신-B가 내부 용액에 균일하게 혼합되었는지 확인하기 위해 피펫으로 용액을 빼내고 제거합니다. 용액은 부드러운 황색을 띱니다.
- 암포테리신-B 천공 패치 내부 용액을 3mL 주사기에 주입합니다. 주사기에 34G 팁을 추가합니다. 주사기를 알루미늄 호일로 싸서 얼음 위에 보관하십시오.
메모: 이 용액은 세포막 천공에서 암포테리신-B의 효과를 보장하기 위해 2시간마다 다시 만들어야 합니다. 암포테리신-B는 빛에 민감하므로 알루미늄 호일 또는 기타 방법을 사용하여 빛으로부터 차폐해야 합니다.
- 패치 클램프 녹음
- 10x 또는 20x 대물렌즈를 사용하여 뉴런을 시각화합니다. 조명을 조정하고 광학 장치를 최적화하여 세포 주변의 경계와 그림자를 확인합니다.
- 분리된 뉴런의 품질을 확인합니다. 너무 강하게 대비되지 않고 작고 분산된 분화구만 있는 매끄럽고 평평한 표면을 가진 뉴런만 시도하십시오. 또한 한 쌍의 뉴런, 파편으로 둘러싸인 뉴런 또는 다른 세포를 피해야 한다.
- 100배 확대 아래에서 패치할 뉴런 또는 뉴런 필드를 식별하고 시야 중앙에 정렬합니다.
- 배양 접시에 넣은 깨끗한 용액에 팁(~20초)을 담궈 암포테리신이 포함되지 않은 깨끗한 용액으로 피펫 끝을 채웁니다. 모세관 작용은 tip.
메모: 실체 해부 현미경에서 이 단계를 수행하면 팁이 Tip Dip 용액을 얼마나 잘 고정하는지 확인할 수 있습니다. 용액이 ~ 10-20 초 동안 유지되지 않으면 전극의 모양이 이상적이지 않습니다. 이 경우 더 긴 팁을 생성하도록 전극 당김 프로그램을 재구성하십시오.
- 다음으로, 피펫 뒷면에 암포테리신이 함유된 내부 용액을 채웁니다. 피펫 내의 필라멘트는 팁의 깨끗한 용액과 만나도록 용액을 끌어 당깁니다. 필라멘트가 용액을 부드럽게 아래로 당기도록 하고 암포테리신이 너무 빨리 팁으로 가해질 수 있으므로 거품을 두드리지 마십시오.
- 주사기를 사용하여 전극 맨 뒤에 있을 수 있는 용액을 뽑습니다.
메모: 이 지점에서 착륙할 때까지 빠르게 작업하고 원하는 셀에 고저항 밀봉을 형성하는 것이 매우 중요합니다.
- 피펫을 피펫 홀더에 삽입합니다. 피펫 드리프트를 방지하기 위해 피펫이 홀더에 꼭 맞는지 확인하십시오. 피펫이 안정적이지 않은 경우 피펫 홀더의 앞면과 뒷면에 있는 밀봉 O-링을 교체하여 드리프트를 최소화하고 강력한 흡입력을 유지하십시오. 피펫을 새로 주입한 피펫으로 교체하십시오.
- 피펫을 녹음실의 욕조로 내립니다.
- 시야각 중앙에서 피펫 팁을 찾습니다. 팁에 기포나 기타 이물질이 없는지 확인하십시오.
- 멤브레인 테스트에서 전압 단계(5mV)를 적용하여 피펫 저항을 모니터링합니다. 셀에 씰을 형성하는 전체 프로세스를 통해 입력 저항을 계속 모니터링합니다.
- 피펫 오프셋 전위를 취소하여 피펫 전류가 pClamp의 멤브레인 테스트 모드에서 0을 읽도록 합니다.
- 패치 클램프 증폭기의 빠른 커패시턴스 보상 기능을 사용하여 피펫 커패시턴스를 수정합니다(Multiclamp Commander 소프트 패널의 Cp 고속 다이얼).
- 피펫을 셀로 이동합니다.
- 파이펫이 뉴런에 충분히 가까워지면 더 높은 배율의 대물렌즈로 전환하고 카메라를 통해 이미지를 모니터로 보냅니다(40x 대물렌즈, 총 400x 배율 사용). 피펫을 조정하고 뉴런을 다시 중심에 놓습니다.
- 기록 전극을 체마에 가깝게 이동합니다. 모니터에서 뉴런의 중심을 찾고 기록 전극을 뉴런 위에 놓습니다.
- 위에서 뉴런에 접근하여 전극이 구형 세포의 중심에 떨어지도록 합니다. 피펫 오프셋을 시스템의 일정한 DC 전위를 0으로 조정합니다.
- 피펫을 멤브레인 가까이에 놓습니다. 셀 중앙에 단단히 착지합니다.
메모: 착륙할 때 뉴런 표면에 작은 딤플링이 발생하고 입력 저항이 두 배/세 배로 증가합니다.
- 주사기 또는 입 피펫을 사용하여 음압(흡입)을 가합니다. -60mV의 유지 전위를 켭니다. 밀봉 저항은 기가 옴을 통과 할 때까지 증가해야합니다 .
메모: 전극을 채우고 셀에 도달하는 사이의 시간을 줄이기 위해 빠르게 작업하십시오. 천공 패치 내부 용액에 첨가된 암포테리신이 전극 팁에 도달하기까지 제한된 시간이 있습니다. 팁이 암포테리신으로 오염되면 고저항 씰을 형성하기 어렵고 저항은 종종 ~200메가옴으로 정체됩니다.
- 기가 옴 씰이 형성되면 음압을 해제합니다. 씰이 형성되자마자 빠른 정전용량 보상을 적용하여 멤브레인 테스트 모드에서 피펫 정전용량 과도 현상의 진폭을 최대한 줄이십시오.
- 암포테리신이 작용하기 시작하면서 입력 저항이 서서히 감소하고 암포테리신이 멤브레인에 진입함에 따라 5mV 전압 단계에 응답하여 흐르는 전류가 점진적으로 증가하는 것을 관찰하십시오. 점진적인 안정화 대신 직렬 저항의 급격한 감소는 자발적인 파열이 발생했음을 시사합니다.
- 전체 셀 커패시턴스와 직렬 저항을 증폭기의 용량성 과도 nulling 기능을 사용하여 추정합니다. 실험 시작 시와 실험 중에 정기적으로 직렬 저항을 문서화하고 모니터링합니다.
메모: 직렬 저항은 전극의 크기와 피펫으로 유입되는 깨끗한 용액의 양에 따라 안정화되는 데 5-20분이 소요될 수 있습니다. 전압 클램프 및 전류 클램프 모드는 직렬 저항이 30메가옴 미만으로 안정화되면 사용할 수 있습니다. 기록 중 뉴런의 팽창 또는 수축이 때때로 관찰되지만 용액의 삼투압과 pH가 올바르게 조정된 경우에는 드뭅니다.