내이 감각 뉴런 세포체의 천공된 패치 클램프 기록

초록

출처: Iyer, M. R., et al. Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings. J. Vis. 특급 (2023).

이 비디오는 내이 감각 뉴런 세포체의 이온 전류를 측정하기 위한 패치 클램프 기술을 보여줍니다. 이 백서에서는 암포테리신 B가 함유된 내부 용액으로 채워진 광택 있는 패치 클램프 피펫의 준비 및 사용에 대해 자세히 설명하며, 이 피펫은 멤브레인을 천공하여 세포 내 상태를 보존하면서 이온 이동을 허용합니다. 전압 펄스는 이온 채널 활동을 트리거하고 기록하기 위해 적용되어 이온 채널 활동과 그 특성에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

1. 녹음

참고: 이 절차에서, 고립된 신경절의 패치 클램프 기록은 일반적으로 도금 후 12-24시간 후에 수행됩니다. 다른 실험실에서는 배양에서 훨씬 더 오랜 기간 후에 뉴런의 결과를 보고했습니다.

1. 녹음실 준비
   1. 배양 접시에서 직접 패치 클램프 녹음을 허용하는 빠른 교환 기록 챔버(또는 이와 동등한 것)를 사용하십시오. 도립 현미경에 챔버를 설정합니다.
   2. 유리 바닥 배양 접시를 챔버에 삽입합니다.
   3. 관류 튜빙 시스템을 통해 L-15 용액을 기록 챔버에 공급합니다. 챔버 내 유입 및 유출 관류를 분당 0.5-1mL의 속도로 안정화합니다.
2. 전극 적재를 위한 내부 용액을 준비합니다.
   1. perforated-patch 내부 용액의 부분 표본을 해동합니다. 35mm 배양 접시에 2.5mL의 용액을 할당합니다. 배양 접시의 뚜껑을 교체하고 "Tip Dip"으로 표시합니다. 이 솔루션을 가능한 한 깨끗하게 유지하는 것이 매우 중요하므로 먼지가 없는 구역에 보관하십시오.
   2. 암포테리신-B 1mg의 무게를 측정하고 20μL의 디메틸설폭사이드(DM....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
암포테리신	시그마-알드리치	A4888-100MG	천공된 패치 기록용.
ATP 디소듐	시그마-알드리치	A7699	내부 용액에 첨가제
염화칼슘2	J.T. 베이커	1311년 1월	내부 용액에 첨가제
디엠소	비오티움	90082
에그타	시그마-알드리치	0396회	내부 용액에 첨가제
전극 풀러	나라시게	PC-10
에탄올	디콘 랩스	2716	헤드 청소 및 해부 벤치 주변용
전극용 Filamented Borosilicate Capillaries	셔터 기기	BF140-117-10
헤페스	시그마-알드리치	H3375-100지	프로토콜의 모든 용액을 pH 완충하기 위해
핫 플레이트/마그네틱 스티러	폭스바겐	76549-914
K2SO4, 황산 칼륨	시그마 알드리치	P9458-250G	내부 용액에 첨가제
케이클	시그마-알드리치	P93333	내부 용액에 첨가제
코 (1m)	니 웰	319376-500ML	내부 용액을 원하는 pH로 가져옵니다.
배양 요리를 위한 Low-profile-bath 녹음 챔버	워너 인스트루먼트	Tel.: 64-0236
MgCl2-헥사하이드레이트	시그마-알드리치	M1028	내부 용액에 첨가제
마이크로피펫 주입용 microFil 바늘 - 34 게이지	세계적인 정밀 기기	MF34G
마이크로포지	나라시게	MF-90	전극 연마용.
염화나트륨	시그마-알드리치	S7653	내부 용액에 첨가제
NaOH (1m)	토마스 사이언티픽	319511-500ML	적정 pH용
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