자유롭게 움직이는 새끼 쥐에서 뇌파검사를 통한 유도 발작 기록

초록

출처: Huo, Q. et al. 새로운 방법을 사용하여 자유롭게 움직이는 신생아 쥐의 EEG 기록. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 발작으로 유발된 새끼 쥐의 뇌파(EEG) 신호 기록을 보여줍니다. 데이터 수집 시스템에 연결된 전극을 이식한 자유롭게 움직이는 강아지를 예로 들어 보겠습니다. 간질 발작을 유발하기 위해 신경독을 투여하고 EEG 신호를 사용하여 그에 따른 전기 파열 활동을 모니터링합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 전극 준비(그림 1A-C)

참고: 컴퓨터 핀 위치는 단순히 통신 장치의 신호 인터페이스의 일부로 갈래 접점입니다. 암 커넥터에 연결되는 수 커넥터로 구성됩니다.

1. 집게를 사용하여 컴퓨터 핀 위치(그림 1A)에서 수형 핀과 암형 핀을 조심스럽게 분리합니다. 암수 핀을 함께 연결하여 전극을 형성하고 시아노아크릴레이트를 적용하여 강력한 접착 결합을 생성합니다(그림 1C).
2. 증류수를 채운 비커에 전극을 넣고 초음파 세척기에 10분 동안 넣고 45°C의 건조 오븐에 30분 동안 넣고 자외선(UV)을 사용하여 전극을 30분 동안 살균합니다.

2. 수술 절차 (그림 1D-F)

1. 멸균된 수술 기구와 정위 기구를 준비합니다. 공기와 함께 isoflurane 마취(2.5%)를 사용하여 신생아 새끼 쥐를 마취합니다. 새끼가 깊이 마취되면 이소플루란의 용량을 1.0%로 조정합니다. 적절한 마취 깊이를 보장하기 위해 수술 전에 꼬리 또는 발가락 꼬집기를 수행하십시오.
2. 이어바를 외이도에 넣고 약간 조여 입위 장치에 강아지의 머리를 고정합니다.
   메모: 신생아 두개골은 매우 부드럽기 때문에 이어바를 과도하게 조이지 마십시오.
3. 모든 장비에 70% 에탄올을 분사하여 멸균 수술 영역을 유지합니다. 메스를 사용하여 머리를 15mm 절개합니다. 집게를 사용하여 두피를 네 모서리의 정중선에서 부드럽게 당겨 빼냅니다. 절개 부위를 활짝 벌리기 위해 식염수에 적신 솜을 피부 아래에 놓습니다(그림 1D).
4. 두개골에서 브레그마(bregma)와 람다(lambda) 점을 찾아 연필로 표시한다. 주사기 바늘(26G)을 사용하여 전전두엽 피질(PFC)과 해마에 두 개의 버 구멍을 만듭니다.
   메모: PFC는 브레그마 뒤쪽 +1.8mm, 정중선 옆으로 -0.5mm 떨어진 곳에 위치하며, 해마는 브레그마 앞쪽 -2.0mm, 정중선 옆쪽으로 ±0.5mm 떨어져 있습니다(그림 1D 및 E). 전극의 깊이는 뇌 손상을 최소화하기 위해 피질 표면에서 2mm 이상 아래에 있지 않아야 합니다.
5. 집게를 사용하여 전극을 잡고 기준 전극과 기록 전극을 각각 PFC와 해마에 삽입합니다. 감염 가능성을 피하기 위해 전극 주위에 에리트로마이신 연고를 바르십시오. 시아노아크릴레이트를 사용하여 전극을 고정합니다.
6. 끈적하고 점성이 있는 농도를 갖도록 치과용 아크릴 시멘트를 준비합니다. 전극과 두개골의 나머지 부분을 덮기 위해 치과 시멘트를 바르십시오.
   메모: 치과용 시멘트를 바르기 전에 두개골을 완전히 말리십시오.
7. 전극에 5% 피크르산을 바르면 전극을 보호할 수 있습니다.
   메모: 전체 절차는 멸균 상태를 유지하기 위해 생물 안전 후드에서 수행되어야 합니다.
8. 정위 안경테에서 동물을 제거하고 300μL의 10% 포도당을 피하로 주입합니다. 회복을 위해 가열된 담요 위에 올려 놓으십시오. 동물이 따뜻하고(37°C) 보행 가능한지(즉, 완전히 회복된) 확인하십시오. 수술 후 통증을 위해 부프레노르핀을 복강내(0.05mg/kg)로 투여합니다.
   메모: 동물이 충분한 의식을 회복할 때까지(즉, 정상적인 행동 및 움직임) 동물을 방치하지 마십시오.
9. 강아지가 의식을 되찾은 후 댐이 있는 집 우리로 되돌립니다. 동물이 완전히 회복될 때까지 이틀 동안 기다립니다.

3. EEG 기록

1. 완전히 회복된 후 강아지의 두개골에 이식된 전극을 자체 케이지의 증폭기에 연결합니다. 연결 ampliifier를 아날로그-디지털 변환기에 연결하고 변환기를 컴퓨터에 연결합니다. 연결선은 엉키지 않도록 조심스럽게 다루어야 합니다.
2. 최소 10,000Hz를 선택합니다.amp기록을 위해 데이터 수집 장치에서 링 속도(송신기의 대역폭은 1-100Hz임). 데이터가 제대로 샘플링되었는지 확인합니다.
3. 기준선 기록을 얻은 후, 간질 발작을 유발하기 위해 강아지에게 카이닌산(KA, 2mg/kg)을 복강내 주사합니다. KA 주사 후 15분 후에 간질 배출을 관찰하고 기록합니다. KA를 통한 발작 생성은 일반적으로 물리적입니다.
   참고: ictal-tonic 지속 시간은 약 15.2 ±0.9 초이고 발작 지속 시간은 약 62±5 초입니다. 신생아 쥐에서 발작은 클로랄 수화물(400mg/kg)을 IP 주사함으로써 예방할 수 있습니다.
4. 디지털화된 데이터를 저장하고 spike2와 같은 신호 처리 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석합니다. 파워 스펙트럼 분석을 수행하여 신생아 EEG 신호에서 다양한 주파수 구성 요소의 파워 레벨을 밝힙니다. 1에서 100Hz(EEG 대역)까지의 제곱평균제곱근 진폭을 찾아 1분 시간 프레임의 전력을 계산합니다.

결과

그림 1: 외과적 임플란트 프로토콜의 그림.(A) 작은 컴퓨터 핀. (B) 암 핀(왼쪽) 및 수 핀(오른쪽). 스케일 바는 암 핀의 길이를 측정하는 데 사용됩니다. (C) 연결된 암수 핀. (D) 노출된 두개골. 1번은 참조 사이트, 2번은 브레그마, 3번과 4번은 녹음 사이트, 5번은 람다입니다. (E) 전극 이식. 1번은 기준 전극을 제시하고, 3번 및 4번은 기록 전극을 제시합니다. (F) 회수된 새끼 쥐(P9).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
컴퓨터 핀
집게	공급자:DELI Group Co., Ltd.
502 슈퍼 접착제	공급자:DELI Group Co., Ltd.	7144
건조 오븐	복선	GZX-9140MBE
이소플루오란	RWD 생명 과학	전화: 902-0000-522
입체택시 장치	RWD 생명 과학	900-0068-507
마취 장치	RWD 생명 과학	Tel.: 902-0000-510
Homeothermic 난방 장치	하버드 기구	케이 024509
증폭기 모델 3000	A-M 시스템	61558
Micro1401 아날로그 디지털 컨버터	케임브리지 전자 디자인 회사	4383	데이터 수집 장치
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