Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices(급성 뇌 절편에서 뉴런 연결의 쌍을 이룬 패치 클램프 기록)

초록

출처: Qi, G., et al. 쌍을 이룬 패치-클램프 기록을 사용한 급성 뇌 절편의 뉴런 미세 회로의 전기생리학적 및 형태학적 특성화. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오는 뇌 절편을 고정하고, 전체 세포 구성을 달성하기 위해 피펫을 배치하고, 시냅스후 반응을 기록하도록 시냅스전 뉴런을 자극하여 뉴런 연결을 매핑하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. Paired Patch-Clamp Recording 및 Biocytin Filling

시냅스 연결의 유형에 따라 시냅스로 결합된 뉴런을 찾기 위해 세 가지 다른 접근 방식이 사용됩니다. 연결 확률이 낮으면(대부분의 흥분성 연결에서 예상할 수 있음) 다음과 같이 진행하십시오.

1. 연결성이 낮은 뉴런 연결
   1. 패치 피펫을 표 1에 나열된 조성물의 내부 용액으로 채웁니다. 전체 세포 구성의 모든 기록에 대해 내부(피펫) 용액에 3 - 5 mg/ml 농도의 바이오사이틴을 첨가하여 시냅스 전 및 시냅스후 뉴런에 대한 양호한 염색 결과를 얻습니다. 바이오사이틴이 최소 15 - 30분 동안 세포로 확산되도록 합니다(뉴런의 크기에 따라 다름).
      참고: 아래에 언급된 '검색' 파이펫에 사용된 용액에 바이오사이틴을 첨가하지 마십시오.
   2. 전체 세포 모드에서 추정되는 시냅스후 뉴런을 패치합니다. 길고 가느다란 생크가 있는 패치 피펫을 사용하십시오. 이는 대물렌즈 아래에서 피펫의 기동성을 용이하게 하고 전극이 슬라이스에 도입될 때 발생할 수 있는 움직임 아티팩트를 줄입니다.
   3. 그런 다음 8 - 10MΩ 저항과 작은 팁 직경의 '검색' 패치 피펫을 사용하여 세포 부착 구성에서 잠재적인 시냅스전 뉴런을 패치합니다. 이 피펫은 '느슨한' 세포 부착 패치를 형성합니다. '검색' 피펫을 K⁺가 Na⁺로 대체된 내부 용액으로 채워서(표 2) 시냅스전 세포를 탐색하는 동안 뉴런이 탈분극되는 것을 방지합니다.
      참고: '느슨한' 밀봉 저항은 GΩ 범위가 아니라 일반적으로 약 30 - 300MΩ입니다.
   4. 현재 클램프 모드에서 '느슨한' 밀봉 아래의 멤브레인 전위를 약 -30 - -60 mV로 유지합니다. 그런 다음 큰 전류 펄스(0.2 - 2 nA)를 적용하여 전위 시냅스 전 세포에서 활동 전위를 유도합니다. 이 활동 전위를 전압 응답에서 작은 스파이클릿으로 관찰하십시오.
   5. 자극 주파수를 0.1Hz로 설정하여 시냅스후 반응의 런다운을 방지합니다. 뇌 조직이 매우 미성숙하거나 시냅스 연결이 매우 신뢰할 수 없는 경우 더 낮은 자극 주파수를 사용하십시오.
   6. '시냅스후' 뉴런이 테스트된 '시냅스전' 뉴런의 자극에 반응하지 않는 경우, '느슨한' 밀봉 모드에서 새로운 뉴런을 패치합니다. 저항이 >30MΩ인 씰이 설정된 한 '검색' 패치 전극을 교체하지 마십시오. 이러한 방식으로 최대 30개의 잠재적으로 시냅스전 뉴런을 테스트할 수 있습니다.
      메모: 느슨한 패치 클램프로 검색 절차 중 뉴런 손상을 방지하려면 전체 세포 패치 피펫에 적용된 것과 비교하여 검색 피펫에 부드러운 흡입만 적용해야 합니다.
   7. '느슨한' 밀봉 모드에서의 자극으로 인해 시냅스후 뉴런에서 5msec <의 잠복기를 가진 EPSP/IPSP(흥분성 시냅스후 전위/억제성 시냅스후 전위)가 발생하는 경우, 시냅스전 뉴런에서 '검색' 피펫을 제거합니다.
   8. '검색' 패치 피펫을 바이오사이틴이 함유된 일반 내부 용액으로 채워진 패치 전극으로 교체합니다. 이 기록 패치 피펫의 저항이 4 - 8 MΩ인지 확인하십시오. SOMA 크기가 클수록 전극 저항이 낮아질 수 있습니다.
   9. 시냅스전 뉴런을 패치하고 전체 세포, 전류 클램프 모드로 기록합니다. 시냅스전 뉴런에 전류 주입으로 활동 전위를 유도하고 시냅스후 반응을 기록합니다. 나중에 오프라인 분석을 위해 컴퓨터에 데이터를 저장합니다.

표 1. 저염화물 피펫 용액.

의 명 년 개 호 분 년 분 년 개 년 년

	밀리미터	g/L	g/50 ml
K-글루코네이트	135	31.622	1.5811
케이클	4	0.298	0.0149
헤페스	10	2.384	0.1192
포스포크레아틴	10	2.552	0.1276
ATP-마그네슘2+	4	2.028	0.1014
GTP-나(나)	0.3	0.156	0.0078
KOH로 pH를 7.3으로 조정
삼투압 ~300 mOsmol/L
3 - 5 mg/ml 바이오사이틴 추가

표 2. 시냅스로 결합된 뉴런을 검색하기 위한 High Na 피펫 솔루션.

의 분 년 분 님 분 년 분 년 개 년 년

	밀리미터	g/L	g/50 ml
Na-글루코네이트	105	22.92	1.146
염화나트륨	30	1.76	0.088
헤페스	10	2.384	0.1192
포스포크레아틴	10	2.552	0.1276
ATP-마그네슘2+	4	2.028	0.1014
GTP-나(나)	0.3	0.156	0.0078
NaOH로 pH를 7.3으로 조정
삼투압 ~300 mOsmol/L

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
증폭기	헤카	EPC 10 USB 트리플	2-3 프리앰프 포함
현미경	올림푸스	BX51WI	2개의 카메라 포트와 4× 대물렌즈, 40× 침수 대물렌즈
사진기	틸 포토닉스	VX55	적외선 CCD 카메라
워크스테이션	루이그스 & 노이만	인프라패치 240	현미경을 위한 전동식 X-Y 스테이지와 전동식 초점 축 포함
마이크로 매니퓰레이터	루이그스 & 노이만	SM-5	2-3 프리앰프용 X-Y-Z 매니퓰레이터
패러데이 케이지	루이그스 & 노이만
방진 테이블	뉴포트 스펙트럼 물리학
패치마스터	헤카
마이크로톰	마이크로미 인터내셔널	HM650V의
마이크로피펫 풀러	헤카	셔터 P-97
Neurolucida 시스템	마이크로 명시야		Neurolucida 및 Neuroexplorer 소프트웨어 사용

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