온전한 쥐 등쪽 뿌리 신경절에 대한 전체 세포 패치 클램프 기록

초록

출처: Gong, K.,et al. 성체 쥐의 온전한 등쪽 뿌리 신경절에 대한 패치 클램프 녹음. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 패치 클램프 기술을 사용하여 유변기저와 막 전위를 측정하고 증분 전류 주입에 대한 뉴런의 반응을 분석하여 등쪽 신경절의 감각 뉴런 흥분성을 검사하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토 및 승인되었습니다.  

1. 패치 클램프 녹음

1. 분해를 방지하기 위해 전극 용액(표 1 참조)을 얼음 위에 놓습니다. 유리 패치 피펫에 여과된 세포 내 용액(주사기 필터, 기공 크기: 0.2μm)을 채우고 헤드 스테이지 피펫 홀더에 피펫을 놓습니다. 피펫을 수조 용액에 내리기 전에 플런저를 약 5ml 정도 이동하여 1ml 주사기를 통해 피펫에 부드럽고 양압적인 압력을 가합니다.
   참고: 이렇게 하면 피펫이 막히는 것을 방지할 수 있습니다.
2. "V-clamp" 모드의 모드 노브를 돌려 ampliifier를 선택한 다음 소프트웨어에서 "멤브레인 테스트" 인터페이스를 엽니다. 피펫을 현미경 검사 대상 표적 뉴런 가까이로 이동합니다.
   메모: 온전한 DRG 제제에서는 위성 신경교세포의 얇은 층이 각 뉴런을 캡슐화합니다.
3. 피펫의 양압을 사용하여 뉴런과 위성 신경교세포의 주변 층 사이의 공간이 갑자기 확대될 때까지 위성 신경교세포층을 횡단합니다. 뉴런에서 "보조개"가 관찰될 때까지 피펫을 뉴런 쪽으로 계속 움직입니다.
   메모: 분리된 뉴런의 기록과 비교할 때 양압은 약간 더 커야 하며, 이는 위성 신경교세포층을 관통하고 성공적인 패치 가능성을 높이는 데 도움이 됩니다.
4. 양압을 줄이십시오. 다음으로, 부드러운 흡입으로 기가 옴 밀봉을 얻습니다.
   메모: 이 방법을 사용하면 녹음 성공률이 70% 이상입니다.
5. 앞에서 설명한 대로 전체 세포 기록 구성을 가져옵니다.
   1. 짧지만 강한 흡입을 통해 뉴런 세포막을 짧게 관통합니다. 또는 흡입이 적용되는 동안 ampliifier의 "zap" 기능.
   2. 전체 셀 모드가 설정되면 증폭기의 커패시턴스 및 저항 보상 노브를 돌려 전체 셀 커패시턴스 및 직렬 저항(Rs)을 보상합니다.
      메모: Rs는 일반적으로 5-20MΩ입니다.
   3. Rs가 초기에 30MΩ보다 크거나 기록 중에 20% 이상 변경되는 경우 셀을 중단합니다. 또한 휴지 막 전위를 측정합니다. 셀이 -50mV 이상인 경우 셀을 포기합니다.
6. "멤브레인 테스트" 창을 닫습니다. "I-clamp normal" 모드는 모드 노브를 돌려 amp리퍼.
7. 소프트웨어에서 "open protocol"을 클릭하고 rheobase 측정을 위한 프로토콜을 선택하고 로드합니다. "녹음"을 클릭하여 녹음을 시작하십시오. 입력 저항과 유변염기를 측정하여 100pA 단위로 등급이 매겨진 일련의 탈분극 전류를 주입하여 신경 흥분성을 검사합니다.
   1. 소프트웨어에서 "open protocol"을 클릭하고 rheobase 측정을 위한 프로토콜을 선택하고 로드합니다. "녹음"을 클릭하여 녹음을 시작하십시오. 입력 저항과 유변염기를 측정하여 100pA 단위로 등급이 매겨진 일련의 탈분극 전류를 주입하여 신경 흥분성을 검사합니다.
   2. 데이터 수집 및 분석 소프트웨어(예: Clampfit)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 기록된 추적을 분석합니다. 소프트웨어는 전달된 과분극 전류 동안의 정상 상태 I-V 관계를 기반으로 입력 저항(Rin)을 계산합니다. 커서를 움직여 rheobase 및 membrane threshold에 대한 값을 측정합니다. 메모: AP를 유도하는 데 필요한 전류의 진폭은 유변염기(rheobase)로 정의되며, AP를 유도하기 위한 가장 낮은 전압은 멤브레인 임계값(membrane threshold)으로 정의됩니다.
8. 리간드 유도 전류를 기록합니다.
   1. 피펫에 특정 작용제를 주입합니다.
      참고: 현재 보고서에서는 100μM 글루타메이트와 100μM AITC를 사용하여 각각 글루타메이트 수용체와 TRPA1 수용체에 의해 매개되는 전류를 유도했습니다.
   2. 피펫 내부에 기포가 없는지 확인하십시오. 피펫 홀더에 피펫을 놓습니다. 피펫 홀더를 약물 분주 시스템에 연결된 튜브에 연결합니다.
   3. 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 뉴런의 50μm 이내로 이동합니다. 약물 분주 시스템 압력을 1psi로 설정하고 지속 시간을 1초로 설정합니다. 녹음 모드를 전압 클램프로 전환하고 -70mV에서 클램프합니다. 약물 분배 시스템을 통해 압력을 간단히 가하여 약물 유도 전류를 기록합니다.

표 1

의 명 분 분 분 년 분 개

세포 내 용액 100ml
농도 (mM)	구성 요소	MW	지
130	KGluconate	234.24
10	케이클	74.55
10	헤페스	238.3
10	에그타
2	마그네슘2*6H2O	203.3
참고: KOH로 pH를 7.4로, 자당과 증류수를 사용하여 삼투압을 260 - 280 mOsm으로 조정합니다. 즉시 사용하기 전에 2mM MgATP, 0.5mM Na2GTP를 추가하고 필터링합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
유리 피펫	셔터	재질 보기 BF150-110-7.5
닻	Havard 장치	Tel.: 64-0250	드리프트를 방지하기 위해 DRG를 안정화합니다.
연동 펌프	WPI (영어)
피펫 풀러	셔터	P97
증폭기	분자 장치	액소패치 200B
디지타이저	분자 장치	1440D
현미경	니콘	FN600
마이크로 매니퓰레이터	셔터	MPC200
탄화원(95% O2, 5% CO2)	지역 의료용 가스 공급 업체

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