Mouse Cochlea의 특정 주파수 영역에서의 리본 시냅스 평가

초록

출처: Yu, S., et al. 마우스 달팽이관의 특정 주파수 영역에서 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가. J. Vis. 특급. (2019).

이 비디오는 쥐 달팽이관의 특정 영역에서 리본 시냅스를 평가하는 방법을 보여줍니다. 면역염색 및 컨포칼 이미징 기술을 활용하여 각 달팽이관 회전에서 서로 다른 주파수 영역에 걸쳐 기능적 시냅스를 식별합니다.

프로토콜

동물 취급과 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 선택

1. 모든 실험에는 성인 C57BL/6J 수컷 마우스(8주령)를 동물 모델로 사용합니다.
   참고: Cdh23의 스플라이스 변형체를 가진 C57BL/6J 마우스는 청각 시스템의 노화를 가속화했으며, 이는 생후 6개월까지 달팽이관의 기저 회전에서 리본 시냅스의 40% 손실과 중간 회전에서 10% 손실로 나타난 것으로 나타났으며, 나이가 들면서 전체 달팽이관에서 이러한 손실이 급격히 증가했습니다. 따라서 청각 연구를 위해 6개월 이상 된 C57BL/6J 마우스를 사용할 때 주의하는 것이 좋습니다. 특정 실험 목적에 따라 다른 마우스 균주를 사용할 수 있습니다.
2. 청력 평가 전에 전문 진단 포켓 검이경을 사용하여 생쥐를 검사하여 외이 또는 중이 병리를 배제합니다. 잠재적인 징후로는 외이도의 체액 또는 고름, 국소 조직의 발적 및 부기, 고막 천공이 포함될 수 있습니다.
   참고: 이러한 질환은 거의 발생하지 않지만, 일단 확인되면 외이 또는 중이 질환이 있는 마우스는 제외해야 합니다.

2. 청력 평가

1. 케타민 염산염(100mg/kg)과 자일라진 염산염(10mg/kg)의 혼합물을 복강내 주사하여 생쥐를 마취합니다. 고통스러운 자극(예: 발가락 꼬집음 반사)을 통해 마취의 깊이를 판단합니다.
   참고: 발가락 꼬집 반사가 완전히 사라지면 동물은 청각 검사를 위한 적절한 마취 깊이에 도달한 것입니다. 양측 ABR(청각 뇌간 반응) 기록에 더 많은 시간이 필요한 경우, 원래의 마취 평면을 복원하기 위해 더 적은 용량(원래 용량의 1/5)의 마취제를 투여합니다. 마취제 과다 복용은 생쥐의 사망으로 이어질 수 있으므로 주의해야 합니다.
2. 온도 조절 가열 패드를 사용하여 마취된 동물의 체온을 37.5°C로 유지합니다. 청력 검사 전반에 걸쳐 간섭을 피하기 위해 마취된 동물을 전기 및 음향으로 차폐된 방에 두십시오.
   참고: 마취 후 저체온증으로 인한 사망을 방지하기 위해 동물이 완전히 깨어날 때까지 전체 절차 동안 생리적 온도를 유지하십시오.
3. 두개골의 꼭지점(기록 전극), 측정된 귀의 귓바퀴 아래 동측 이하선 영역(기준 전극) 및 반대쪽 귀밑선 영역(접지 전극)에 각각 마우스 머리 피부 아래 20mm 깊이의 피하 바늘 전극(28mm, 3G)을 배치합니다.
4. 폐쇄 필드 스피커를 사용하여 끝이 원뿔 모양의 2cm 플라스틱 튜브를 통해 음향 자극을 수행합니다. 팁을 외이도에 끼웁니다.
   알림: 기록 및 참조 전극의 전기 임피던스가 3kOhm(일반적으로 1kOhm) 미만인지 확인하십시오. 임피던스가 높으면 전극의 삽입 부위를 변경하거나 전극을 알코올로 청소하거나 전극을 교체하여 ABR 파동 진폭의 변경을 방지하십시오.
5. ABR 녹음의 경우 톤 핍(3ms 지속 시간, 1ms 상승/하강 시간, 21.1/s의 속도, 주파수: 4–48kHz)을 생성하고 5-10dB SPL 단계에서 90dB에서 10dB로 감소하는 음압 레벨(SPL)로 표시합니다. 이 단계에서 응답은 증폭(10,000회), 필터링(0.1–3kHz) 및 평균화(1,024개 샘플/자극 수준)됩니다.
   참고: ABR은 각 자극 레벨에 대해 10dB 단계로 수집되며, 임계값 근처에 추가로 5dB 단계가 수집됩니다.
6. 각 주파수에서 육안 검사로 명확하게 식별할 수 있는 하나 이상의 구별 가능한 파동으로 신뢰할 수 있는 ABR 기록을 생성하는 최소 SPL을 나타내는 ABR 임계값을 결정합니다.
   참고: 일반적으로 파형의 일관성을 보장하기 위해 임계값 주변의 낮은 SPL에 대해 프로세스를 반복해야 합니다. 응답 임계값은 5dB의 감소로 인해 파형이 사라질 때 파형을 관찰할 수 있는 가장 낮은 자극 수준입니다.

3. 달팽이관 조직 처리

1. ABR 기록 후 경추 탈구를 통해 마취된 마우스를 안락사시키고, 목을 베고, 복부 쪽에서 수포를 노출시킨 다음, 날카로운 가위로 열어 달팽이관에 접근할 수 있도록 합니다.
2. 가는 집게를 사용하여 측두골을 제거하고, 등골 동맥을 절단하고, 타원형 창에서 등골을 제거하고, 둥근 창막을 파열합니다. 달팽이관 끝(13mm, 27G)을 부드럽게 돌려 달팽이관 꼭대기에 작은 구멍을 뚫습니다.
3. 분리된 뼈를 4°C에서 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 4%(wt/vol) 파라포름알데히드로 하룻밤 동안 고정합니다.끝이 가는 피펫을 사용하여 타원형 또는 원형 창(입구)과 정점의 개구부(출구)에 적용하여 주림프 공간을 통해 고정액을 부드럽게 씻어냅니다.
   참고: 일부 단백질은 면역 표지를 위한 항원결정기의 파괴를 피하기 위해 짧은 고정 기간이 필요합니다. 이러한 경우, 면역조직화학에 대한 제조업체의 지침에 따라 실온(RT)에서 2시간 동안 4% 파라포름알데히드에 함유된 뼈를 배양합니다. 고정은 또한 심장 관류를 통해 수행하여 달팽이관 혈액을 제거할 수 있으며, 특히 달팽이관 시냅토병증의 마우스 모델에서 후기 단계에서 비특이적 염색으로 인한 배경 소음을 피할 수 있습니다.
4. 잔류 파라포름알데히드를 제거하기 위해 0.1M의 차가운 PBS로 5분 동안 뼈를 세 번 헹굽니다. 10% 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 실온에서 4시간 동안 또는 4°C에서 24시간 동안 20rpm의 수평 셰이커에서 부드럽게 흔들어 뼈를 석회질을 제거합니다. EDTA는 중간에 새로 고칠 수 있습니다 .
   참고: 석회질 제거 시간은 EDTA 농도 및 사용자의 선호도에 따라 달라질 수 있습니다. 탈석회화된 조직은 어느 정도의 인성을 유지해야 하며, 이는 이후 단계에서 달팽이관 전체를 분리하는 조작을 용이하게 합니다. 측두골은 회전을 통해 10% EDTA로 석회질 제거될 수 있으므로 연구원들은 ABR 테스트 및 고정 실험 후 실험실을 떠날 수 있습니다. 석회질 제거 시간은 4°C에서 20-30시간 범위 내에서 유연합니다.
5. 석회질화된 측두골 1개를 EDTA에서 0.1M PBS로 전송합니다. #3 및 #5 Dumont 겸자와 27G 바늘을 사용하여 정점, 중간, 기저 달팽이관 영역을 차례로 절개한 다음 실체 해부 현미경으로 달팽이관을 뼈에서 절개합니다. 면도날을 사용하여 나선형 인대를 따라 일련의 작은 절단을 만들고 구조막과 Reissner의 막을 제거합니다(그림 1).
   참고: 절개된 달팽이관이 손상되지 않은 한, 이 프로세스는 개별 작업자의 일반적인 프로토콜에 따라 수정할 수 있습니다.
6. 또한 나선형 변두를 포함한 나머지 청각 상피를 개별 달팽이관 회전(정점, 중간 및 후크 영역이 있는 기저부)으로 해부하여 전체 마운트 준비를 합니다.
7. 광학 현미경의 40x 오일 대물렌즈 아래에서 접안렌즈에 배치된 250μm 스케일로 기저막 길이를 측정하며, 이는 IHC의 입체섬모를 따라 조정할 수 있습니다.
8. 모든 세그먼트 길이(세그먼트당 250μm)를 더하여 각 달팽이관 회전의 길이를 계산하고, 동시에 각 회전의 길이를 합산하여 기저막의 총 길이를 구합니다.
9. 갈고리 영역을 포함한 기저막의 총 길이를 달팽이관 정점으로부터의 거리에 따른 백분율로 변환합니다(0%는 달팽이관 정점, 100%는 달팽이관 기저부를 나타냄).
10. 앞서 설명한 바와 같이 로그 함수(d(%) = 1 - 156.5 + 82.5 × log(f))를 사용하여 이 거리를 달팽이관 특성 주파수로 변환하고, 1.25mm/옥타브 주파수의 기울기를 가지며, 여기서 d는 달팽이관 정점에서 정규화된 거리(%), f는 주파수(kHz)입니다)를 사용합니다. 따라서 각 달팽이관 회전에서 기저막의 해당 영역에 있는 주파수 범위를 얻을 수 있습니다.

4. 면역형광 염색

1. 해부 후, 각 인공와우를 별도의 2.5mL 원심분리 튜브에 넣고 인공와우를 10% 염소 혈청/PBS/0.1% 트리톤 X-100으로 1시간 동안 회전기로 배양합니다.
2. 해부 현미경으로 200 μL 피펫 팁을 사용하여 각 튜브에서 위의 차단/투과 용액을 제거하고 rotator.
   에서 4 °C에서 밤새 5% 염소 혈청/PBS/0.1% Triton X-100으로 희석된 1차 항체로 검체를 배양합니다 참고: 달팽이관 시냅스 리본의 면역 표지를 위해 시냅스전 마커 마우스 항카르복실 말단 결합 단백질 2 IgG1(CtBP2, RIBEYE 스캐폴딩 단백질의 B 도메인 라벨링, 1:400) 및 시냅스후 마커 마우스 항-글루타메이트 수용체 2 IgG2a(GluR2, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid 또는 AMPA receptor의 서브유닛 라벨링, 1:200)를 사용합니다.
3. 0.1M 차가운 PBS로 5분 동안 3회 헹궈 잔류 1차 항체를 제거하고 5% 염소 혈청/PBS/0.1% 트리톤 X-100에 희석된 2차 항체로 검체를 배양합니다.
   참고: 4.2단계에서 사용된 1차 항체를 보완하는 염소 항 마우스 Alexa Fluor 568(IgG1, 1:500) 및 염소 항 마우스 Alexa Fluor 488(IgG2a, 1:500)을 사용하여 적절한 2차 항체 혼합물을 준비합니다. 시냅스 리본에 대한 라벨링 효율성을 개선하려면 특정 2차 항체를 선택하는 것이 좋습니다. 일부 실험실에서는 GluR2 면역 표지를 증가시키기 위해 2차 항체로 배양을 확장합니다.
4. 0.1 M PBS로 5분 동안 3회 헹궈 잔류 2차 항체를 제거하고 검체를 2.5 mL 원심분리 튜브에서 0.1 M PBS가 포함된 35 mm 플레이트로 옮깁니다.
5. 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)이 포함된 장착 매체 한 방울을 슬라이드에 놓고 PBS에서 장착 매체로 표본을 옮깁니다. 커버슬립의 한쪽 가장자리를 슬라이드에 놓고 놓아 커버슬립이 부드럽게 떨어지도록 합니다.
   참고: 유모 세포가 위를 향하고 시술 중에 달팽이관 표본이 접히거나 뒤틀리지 않도록 하려면 실체 해부 현미경 아래에 달팽이관 표본을 장착하십시오.
6. 슬라이드를 4°C의 슬라이드 상자에 하룻밤 동안 넣어 건조시킨 다음 레이저 컨포칼 현미경으로 이미지화합니다.

5. 달팽이관 리본 시냅스의 형태학적 평가

1. 405nm UV 다이오드, 488nm 아르곤 레이저 및 561nm 다이오드 펌핑 고체 상태(DPSS) 레이저의 세 가지 레이저가 있는 컨포칼 현미경을 사용하여 DAPI(여기 스펙트럼 409–464nm), Alexa Fluor 488(여기 스펙트럼 496–549nm) 및 Alexa Fluor 568(여기 스펙트럼 573–631nm)을 여기시키려는 이미지 슬라이드, 각각.
2. 63x 고해상도 오일 이멀젼 렌즈를 사용하여 달팽이관을 돌릴 때마다 8μm 거리에 걸쳐 컨포칼 z-스택을 획득할 수 있습니다.
   참고: 일단 정의되면 현미경 사진을 디지털화하기 위한 모든 매개변수를 저장하고 모든 슬라이드에 균일하게 적용해야 합니다.
3. 시냅스 반자 수의 경우, z-스택(0.3μm 단계 크기)을 내부 유모 세포(IHC)의 전체 길이에 걸쳐 설정하여 모든 시냅스 반점을 이미지
화할 수 있습니다.
4. puncta가 포함된 이미지를 z-스택에 병합하여 z-축 투영을 얻고 이미지 처리 소프트웨어로 가져옵니다.
5. 특정 빈도 영역에서 각 z-스택의 시냅스 총 수를 IHC 수(DAPI 핵 수동 수와 동일)로 나누어 각 IHC에 대한 시냅스 반점 수를 계산합니다. 각 특정 주파수 영역에서, 9–11 IHCs를 포함하는 서로 다른 미시장의 3개 이미지에서 모든 시냅스 반점의 평균을 구합니다.
   1. 자유형 선택 버튼을 사용하여 각 IHC의 기저 영역을 포함한 관심 영역(ROI)을 간략하게 설명합니다. measure 함수는 puncta의 자동 정량화를 위해 사용하고, watershed 함수는 밀접하게 인접한 지점을 구분할 수 있습니다.
   2. 각 자동 계수 후 수동 수정을 통해 육안 검사를 수행하여 펑크 계수의 신뢰성을 확인하십시오.
      참고: 실험자는 슬라이드가 달팽이관의 정점, 중간 또는 기저 회전에서 왔는지 여부에 대해 맹검 상태를 유지해야 합니다.
세포골격
6. 구조와 시냅스 국소화를 더 잘 시각화하기 위해 Pencil Tool(M)을 사용하여 개별 IHC를 이웃과 수동으로 분리하기 위해 시냅스 구조 및 분포를 시각적으로 평가합니다.
7. 시냅스전 리본(CtBP2)과 시냅스후 수용체 패치(GluR2)의 병치를 검사하려면 Rectangular Marquee Tool을 사용하여 리본 주위의 복셀 공간을 추출하고 Crop별로 개별 리본을 분리합니다. Image > Image Size를 클릭하여 이러한 미니어처 투영의 썸네일 배열을 얻은 다음, 쌍을 이루는 시냅스(CtBP2 양성 및 GluR2 양성 반점의 밀접하게 병치된 쌍으로 나타남)와 고아 리본(시냅스후 글루타메이트 수용체 패치 부족)을 식별하는 데 사용할 수 있습니다(그림 2).
   참고: 정상적인 달팽이관 시냅스는 유모 세포 내의 시냅스전 리본(anti-CtBP2)과 청각 신경 말단의 시냅스후 글루타메이트 수용체 패치(anti-GluR2)의 결합된 면역 표지로 나타납니다. 일부 실험실에서는 3D 모델링과 함께 컨포칼 투영을 사용하여 시냅스 패치 크기 또는 부피를 정량화합니다. 리본 시냅스가 크게 손실되기 전에 리본의 크기 변화를 보이거나 한 쌍의 글루타메이트 수용체 패치가 없는 리본은 시냅스 기능 장애를 나타낼 가능성이 높습니다.

결과

그림 1: 생쥐의 달팽이관 주파수 국소화.(A) 실체 해부 현미경으로 측두골을 절개한 완전히 이식된 달팽이관의 대표 이미지. (B) 쥐 달팽이관은 정점(apical), 중간(middle), 기저(basal turn)로 나뉘며, 여기서 달팽이관 측벽(cochlear lateral wall)이 제거됩니다. 달팽이관 기저막 조각에 있는 빨간색 원은 달팽이관 내의 주파수 위치와 해당 정규화된 위치를 나타냅니다(0%는 달팽이관 정점, 100%는 달팽이관 기저부를 나타냄). 눈금 막대 = 250μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케타민 염산염	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., 중국 푸젠	H35020148	100 마그네슘 / kg
자일라진 염산염	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	엑스-1251	10 마그네슘 / kg
TDT 생리학 기구	Tucker-Davis Technologies, 미국 플로리다주 앨라추아	청각 생리학 시스템 III
SigGen/BioSig 소프트웨어	Tucker-Davis Technologies, 미국 플로리다주 앨라추아	청각 생리학 시스템 III
전기 패드	애완 동물의 즐거움	11072931136
Dumont 집게 3#	Fine Science Tools, 노스 밴쿠버, 브리티시 컬럼비아, 캐나다	0203-3-PO
Dumont 집게 5#	Fine Science Tools, 노스 밴쿠버, 브리티시 컬럼비아, 캐나다	0209-5-포
실체 해부 현미경	Nikon Corp., 일본 도쿄	SMZ1270
염소 세럼	ZSGB-BIO, 베이징, 중국	ZLI-9021
항-글루타메이트 수용체 2, 세포외, 클론 6C4	Millipore Corp., 미국 매사추세츠주 빌레리카	MAB397	마우스
정제된 마우스 Anti-CtBP2	BD Biosciences, 미국 매사추세츠주 빌레리카	612044	마우스
Alexa Fluor 568 염소 안티 마우스 IgG1항체	Thermo Fisher Scientific Inc., 미국 매사추세츠주 월섬	A21124	염소
Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG2a 항체	Thermo Fisher Scientific Inc., 미국 매사추세츠주 월섬	A21131	염소
DAPI를 포함하는 장착 매체	ZSGB-BIO, 베이징, 중국	ZLI-9557
컨포칼 형광 현미경 검사	Leica Microsystems, 독일 베츨라	TCS SP8 II
Image Pro Plus 소프트웨어	Media Cybernetics, 베데스다, 메릴랜드, 미국	버전 6.0
전문 진단 포켓 검이경	Lude 의료 기기 및 기기 무역 유한 회사, 상하이, 중국	HS-OT10
바늘 전극	친교 의학 전자공학 Co., 주식 회사, 시안, 중국	1029	20mm, 28G
폐쇄 필드 스피커	Tucker-Davis Technologies, 미국 플로리다주 앨라추아	CF1

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