출처: Fuchs, Q. et. al., 글루타메이터성 뉴런과 소아 고급 신경교종 세포를 전기적 상호 작용을 평가하기 위한 미세유체 장치로 공동 배양. J. Vis. 특급 (2021)
이 비디오는 다전극 어레이가 있는 미세유체 장치를 사용하여 hiPSC 유래 피질 글루타메이터 뉴런과 신경교종 세포의 공동 배양에서 뉴런 전기 활동을 평가하는 방법을 보여줍니다.
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방법 논문
공동 배양에서 글루타메이트성 뉴런과 신경교종 세포 상호작용 평가
868 조회수
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2025년 7월 8일
이 논문에서
초록
프로토콜
검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 공동 문화 프로토콜
- 공동 배양을 시작해야 할 때 UW479 및 BT35 세포주가 융합 세포의 80%에 도달하도록 시딩일과 농도를 조정하며, 이는 글루타메이터성 뉴런의 배양 기간 21일에 해당합니다.
- UW479 및 BT35 세포를 트립신화하고 각 전용 미세유체 장치(각 세포 유형에 대해 900 cell/mm2의 목표 밀도)의 글루타메이터성 뉴런 상단에 파종한 후 소아 고급 신경교종(pHGG) 세포를 성숙한 글루타메이터성 뉴런이 포함된 미세유체 장치에 파종합니다.
- 표 1에 자세히 설명 된 글루타 메이터 성 뉴런 Day11 및 이후 배지를 사용하여 통제 된 환경 (37 ° C, 5 % CO2)에서 2 일 동안 공동 배양을 유지하십시오.
- 이미지 분석 소프트웨어로 분석된 현미경 사진을 사용하여 pHGG 세포의 생존력을 평가합니다. 셀의 백분율을 계산합니다.
참고: 다음 공식을 사용합니다: 100 - ((D23의 셀 수 / D21의 셀 수) x 100).
2. 전기생리학적 기록
- 상용 시스템 및 상용 소프트웨어를 사용하여 전기생리학적 기록을 수행합니다.
메모: 실험은 100μm 간격으로 30μm 직경의 전극으로 구성된 다중 전극 어레이(MEA)로 수행되었습니다. - pHGG 세포를 파종하기 전에 D21에서 글루타메이터성 뉴런에 대한 첫 번째 전기생리학적 기록을 수행합니다. 분화된 글루타메이터 뉴런을 대조군으로 사용하고 공동 배양과 병행하여 단독으로 배양합니다. 번호가 3인 다음 단계에 설명된 대로 두 조건에 대해 두 번째 기록을 수행합니다.
- D23에서 두 번째 전기생리학적 기록을 수행합니다(공동 배양 2일 후).
표 1: hiPS 유래 글루타메이터 뉴런에 대한 배양 배지 조성.
표시기| 구성 요소 | 파종 매체 | D4 미디엄 | D7 미디엄 | D11 이상 매체 |
| DMEM/F-12 중형 | 0.5배 | 0.25배 | 0.125배 | Ø |
| Neurobasal 배지 | 0.5배 | 0.25배 | 0.125배 | Ø |
| BrainPhys 미디엄 | Ø | 0.5배 | 0.75배 | 1배 |
| SM1 보충제 | 1배 | 1배 | 1배 | 1배 |
| N2 보충제-A | 1배 | 1배 | 1배 | 1배 |
| 알라 - GLN (GlutaMax) | 0.5 밀리미터. | 0.5 밀리미터. | 0.5 밀리미터. | 0.5 밀리미터. |
| 증권 시세 | 10 ng / mL | 10 ng / mL | 10 ng / mL | 10 ng / mL |
| 지그엔프 | 10 ng / mL | 10 ng / mL | 10 ng / mL | 10 ng / mL |
| 재질 보기 TGF-β1 | 1 ng / mL | 1 ng / mL | 1 ng / mL | 1 ng / mL |
| 겔트렉스 | 30 μg/mL | Ø | Ø | Ø |
| 파종 보충제 | 1배 | Ø | Ø | Ø |
| 4일차 보충제 | Ø | 1배 | Ø | Ø |
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | 엠씨에스 | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 홀 카운터용 40μm 프로브 | 더처 | 53750 | |
| 셉터 카운터용 60μm 프로브 | 더처 | 51999 | |
| 알라-Gln(글루타맥스) | 시그마 | G8541 | |
| 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛 | 써모 사이언티픽(Thermo Scientific | HERA사페 타입 KS12 | |
| 피질 글루타메이터성 뉴런 | 브레인셀 | BX-0300 | |
| DMEM/F12 미디엄 | 시그마 | D8437 | |
| DPBS 1배 | 더처 | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM 세포 배양 플라스크 75cm3 | 눕크 | 156499 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | 더처 | 500105 | |
| 지그엔프 | 페프로텍 | 450-10 | |
| 겔트렉스 | 생명 기술 | A1413201 | |
| 인간 BDNF | 페프로텍 | 450-02 | |
| 부 화기 | 멤메르트 | IC0150메드 | |
| MEA2100 | 엠씨에스 | 제181205-MEA2100-11240 | |
| 마이크로피펫 P10 | 싸토리우스 | LH-729020 | |
| 마이크로피펫 P100 | 싸토리우스 | LH-729050 | |
| 마이크로피펫 P1000 | 싸토리우스 | LH-729070 | |
| 마이크로피펫 P200 | 싸토리우스 | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | 더처 | 33290 | |
| 멀티채널 실험자 | 엠씨에스 | - | |
| N2 보충제-A | 스템셀 | 7152 | |
| Neurobasal 배지 | 생명 기술 | 21103049 | |
| Neurocult SM1 신경 보충제 | 스템셀 | 5711 | |
| L-글루타민이 없는 비필수 아미노산(NEAA) | 더처 | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | 드러먼드 | 4000202/4038202 | |
| 세포 배양용 피펫 10 mL Falcon® | 더처 | 357551 | |
| 세포 배양용 피펫 5 mL Falcon® | 더처 | 357543 | |
| 플라크 쇼팡트(CultureTemp) | 벨라트 | 370151000 | |
| 폴리-D-라이신 | 시그마 | P6407 | |
| Primovert 현미경 | 자이스 | 415510-1100-000 |
