전극 배열과 광섬유를 마우스 해마에 이식

초록

출처: Bender, F., et. al., 행동하는 마우스에서 해마 세타 진동의 광유전학적 동반. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 마우스 모델의 해마에 와이어 전극 어레이와 광섬유를 정위 이식하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 광섬유 준비 (그림 1A)

1. 다중 모드 광섬유 (105 μm 코어, 실리카 코어가있는 유리 피복, 0.22 NA)을 사용합니다. 광섬유가 파이버 스풀에 여전히 부착되어 있는 동안 마이크로 스트리퍼를 사용하여 파이버 코어의 125μm 클래딩을 벗겨냅니다.
2. 다이아몬드 나이프를 사용하여 섬유를 약 2-3cm 길이로 자릅니다.
3. 지르코니아 세라믹 스틱 페룰(ID: 126μm)에 섬유를 삽입합니다. 광섬유의 약 0.5-1mm가 페룰의 볼록한 쪽에서 돌출되어야 합니다.
4. 바늘을 사용하여 페룰의 양쪽 끝에 에폭시 접착제 한 방울을 바르되 페룰의 측면에는 바르지 마십시오. 또는 슈퍼 접착제를 사용하십시오.
5. 접착제를 최소 30분 동안 건조시킵니다.
6. 다이아몬드 래핑 섬유 연마 필름(3μm 그릿)을 사용하여 페룰의 볼록한 면을 연마합니다.
7. 광 파워 미터를 사용하여 광 전송의 충실도를 테스트합니다.
   1. 파워 미터의 파장을 사용 중인 레이저와 동일한 파장으로 설정합니다.
   2. 끝이 센서 중앙을 향하도록 패치 코드를 배치합니다. 레이저의 전원을 켜고 전력계에서 출력되는 광을 읽습니다. 값을 기록합니다.
   3. 짝을 이루는 슬리브를 통해 광섬유를 패치 코드에 연결하고 광섬유의 끝이 센서 중심을 향하도록 배치합니다. 레이저의 전원을 켜고 전력계에서 출력되는 광을 읽습니다. 값을 기록합니다.
   4. 두 번째 값을 첫 번째 값으로 나누어 전송 속도를 계산합니다. 전송 속도가 0.5 미만이면 광섬유를 폐기하십시오. 그렇지 않으면 이식에 사용하십시오.
   5. 이식하기 전에 각 섬유의 투과율을 테스트하십시오.
   6. 이후 실험을 위해 레이저의 광도 출력을 광섬유의 전송 속도로 조정하십시오.패치 코드 팁의 광 출력을 5-15로 나누어 전송 속도로 나누어 5-15mW의 광섬유 팁에서 최종 광 출력을 얻습니다.

2. LFP 녹음을위한 텅스텐 와이어 어레이 준비 (그림 1B)

1. 여러 개(예: 6개)의 100μm 실리카 튜브 가이드를 테이프 조각의 끈적한 면과 병렬로 붙입니다. 하나의 와이어 어레이 어셈블리에 대해 약 4-6mm의 한 조각을 자릅니다.
2. 폼바 절연 45μm 텅스텐 와이어를 집게를 사용하여 가이드 튜브를 통해 끼웁니다.
3. 메스를 사용하여 양쪽 끝의 절연체를 긁어내어 6개의 에나멜 절연 미세 구리 본딩 와이어(약 5mm 길이)와 접지선(약 2-3cm 길이)을 벗겨냅니다. 나노 커넥터 핀에 납땜합니다.
4. 은 전도성 페인트 한 방울을 사용하여 각 본딩 와이어를 하나의 텅스텐 와이어에 각각 연결합니다. 최소 30분 동안 건조시키십시오.
5. 전선을 덮기 위해 최소한의 시멘트를 바르십시오. 뇌 조직에 삽입될 텅스텐 와이어나 나노 커넥터의 상부에 시멘트를 바르지 마십시오. 시멘트를 최소 30분 동안 건조시킵니다.
6. 뭉툭한 스테인리스강 가위를 사용하여 텅스텐 와이어를 각도 절단(5-20°)하여 세타 진폭이 너무 낮아 동반 충실도를 추정할 수 없는 피라미드 층에 인접한 구역 아래 또는 위에 와이어를 안정적으로 이식할 수 있습니다.
7. 절연체를 긁어내기 위해 메스를 사용하여 접지선의 끝(약 2mm)을 절연합니다. 플럭스와 프리 솔더로 처리하십시오.
8. 디지털 멀티미터를 사용하여 전극 간의 잠재적인 누화를 확인하십시오. 커넥터 핀을 저항 측정 모드로 설정해야 하는 멀티미터에 연결합니다. 채널의 쌍별 조합을 확인하십시오. 5MΩ 미만의 멀티미터에서 판독값은 상당한 누화를 나타냅니다.
9. 임피던스 미터를 사용하여 식염수로 된 각 와이어 전극의 임피던스를 확인하십시오. 일반적인 임피던스 값은 100kΩ 미만입니다.
10. 이식을 용이하게 하려면 하나의 광섬유를 와이어 어레이에 붙여서 섬유의 끝이 가장 짧은 와이어 수준에 있고 섬유 팁이 텅스텐 와이어에 닿지 않도록 가깝습니다. 이식 중 조직 손상을 방지하기 위해 섬유의 각도를 가능한 한 작게 유지하십시오.

3. 입체 임플란트

1. 두개골 상단에서 결합 조직을 제거하고 목 근육을 약 2mm 정도 철저히 눌러 기록 중 근육 인공물을 방지합니다.
2. 면봉 애플리케이터와 식염수를 사용하여 두개골을 세척하고 4개의 구멍(앞쪽에 2개, 소뇌 위쪽 2개, 직경 0.8mm)을 뚫어 임플란트의 접지 및 안정화를 위해 뼈 스테인리스 스틸 나사(00-96x1/16)를 놓습니다(그림 1D). 소뇌 위에 하나의 구리선(길이 약 2-3cm)에 연결된 접지 나사를 놓습니다.
3. 전기 생리학적 기록 중 근육 인공물을 방지하기 위해 접지 나사를 시멘트로 완전히 덮으십시오. 모든 나사를 연결하는 시멘트 링을 만듭니다(그림 1E).
4. 착상 쪽 위에 개두술을 수행합니다(브레그마와 관련하여 Hippocampus, AP -1.94, L 1.4, V 1.4). 뇌 조직 표면에 약 5μL의 멸균 NaCl을 도포합니다.
5. 개두술에서 stereotaxis를 사용하여 와이어 어레이를 천천히 내립니다. 단일 녹음의 경우 와이어 어레이 대신 실리콘 프로브를 이식합니다. 광전기 광 아티팩트를 방지하려면 광섬유 팁이 프로브를 직접 향하지 않도록 해마에 광섬유를 별도로 이식합니다(그림 1C-I). 반구 사이의 동반 배합을 조사하기 위해 반대쪽 해마 CA1 영역에 추가 광섬유를 이식합니다.
6. 뇌 조직을 보호하기 위해 약 5μL의 따뜻한 액체 왁스/파라핀 오일을 70°C로 예열하고 이식 부위 위에 주사기를 바릅니다.
7. 와이어 어레이 주위에 시멘트를 바르고 두개골을 시멘트로 덮습니다.
8. 예를 들어 바늘을 사용하여 사전 납땜된 접지선/기준선과 접지 나사에 연결된 사전 납땜된 전선에 플럭스 한 방울을 바르고 납땜 기계를 사용하여 전선을 융합합니다.
9. 접지선 전체를 시멘트로 덮습니다.
10. 수술 후 및 최소 2일 동안 0.3mL Erycinum(멸균 NaCl 중 1:4) 및 카프로펜(5mg/mL) ip를 투여합니다. 마우스는 일반적으로 수술 후 15분 이내에 깨어납니다. 회복 속도를 높이기 위해 빨간 램프로 동물을 따뜻하게 하십시오.
11. 수술 후 첫 주 동안 또는 안정될 때까지 매일 마우스의 체중을 모니터링하십시오. 체중 감소는 수술 전에 기록된 마우스 체중의 10%를 초과해서는 안 됩니다. 체중 안정화를 가속화하려면 수술 후 처음 며칠 동안 마우스에게 습식 사료와 연유를 공급하십시오.
12. 동반 중 해마 세포 활동을 기록하려면 해마에 실리콘 프로브를 이식합니다(AP -1.94, L 1.4, V 1, 이후 낮춤)(그림 1C-I). AP -3, L 1.4, V 1.6, 39° 꼬리-꼬리 상부의 해마에 광섬유를 이식합니다. 세포 소마타의 자극이 필요한 경우 MS에 추가 광섬유를 이식합니다(AP +0.98, L 1, V 3.9, 15° 측면).

결과

그림 1: 광섬유, 전극 및 수술 그림. (A) 광섬유의 그림. (B) 해마 세타 진동의 동반 동안 해마 LFP의 기록을 위해 광섬유에 접착된 와이어 어레이의 그림. (C) 해마 세포 활동을 기록하기 위해 실리콘 프로브가 마이크로 드라이브에 장착됩니다. (D) 미니어처 나사가 두개골에 위치합니다. 구리선은 소뇌 위에 배치하기 전에 접지 및 참조 나사에 미리 납땜됩니다. (E) 나사를 덮고 연결하기 위해 시멘트가 도포됩니다. 위쪽 파란색 원은 실리콘 프로브의 이식을 위해 개두술이 수행된 위치를 나타냅니다. 아래쪽 파란색 원은 해마에 광섬유를 이식하기 위해 개두술이 수행된 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PV-Cre 마우스	잭슨 연구소	나6; 129P2-PVALBTM1(cre)Arbr/J
스테레오택시	David Kopf Instruments, 미국 캘리포니아주 투중가	모델 963	초정밀 소형 동물 입체 기구
드릴 비트, 0.8mm	Bijoutil, Allschwil, 스위스	49080흠
납땜 스테이션	Weller Tools GmbH, 베지그하임, 독일	재질 보기 WSD 81
에리스로마이신	Rotexmedica GmbH, Trittau, Germany	PZN: 10823932	주입을 위한 해결책을 위한 1g 분말
정밀 드릴/그라인더	Proxxon, Wecker, 룩셈부르크	FBS 240/E
다중 모드 광섬유	ThorLabs, 독일 다하우	FG105LCA	0.22 NA, Low-OH, Ø105 μm 코어, 400 - 2400 nm
세라믹 스틱 페룰	Precision Fiber Products, 미국 캘리포니아주 밀피타스	CFLC126	세라믹 LC MM 페룰, ID 126um
연마지	쏘랩스	LF3D	6 "x 6"다이아몬드 래핑 (연마) 시트
파워 미터	쏘랩스	미세먼지100D	소형 전력 및 에너지 미터 콘솔, 디지털 4인치 LCD
다중 모드 광섬유 커플러	쏘랩스	FCMM50-50A-FC	1x2 MM 커플러, 50:50 분할 비율, 50 μm GI 파이버, FC/PC
광섬유 패치 코드	쏘랩스	FG105LCA 커스텀 MUC	주문품, 3개 긴 m, 방어적인 배관과 더불어, 배관: FT030의 연결관 1: FC/PC, 연결관 2: 1.25mm (LC) 세라믹 깃봉
소매	Precision Fiber Products, 미국 캘리포니아주 밀피타스	아달1	Ø1.25mm(LC/PC) 페룰용 세라믹 분할 결합 슬리브
텅스텐 와이어	California Fine Wire Company, 그로버 비치, 캘리포니아, 미국	CFW0010954	40 μm, 99.95%
모세관 튜빙	옵트로닉스	1068150020	내ID: 100.4 μm
옴네틱스 나노커넥터	Omnetics Connector Corporation, 미국 미니애폴리스	A79038-001
나사	Bilaney, 뒤셀도르프, 독일	00-96배1/16	스테인리스 스틸
은 전도성 페인트	Conrad electronics, 독일	530042
액체 플럭스	Felder GMBH Löttechnik, 오버하우젠, 독일	뢰쇼 ST	DIN EN 29454.1, 3.2.2.A(F-SW 11)

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