해마 네트워크 역학의 광유전학적 제어

초록

출처: Manseau, F., et al. Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit(해마 세타 밴드 체외에서 튜닝: 고립된 설치류 Septohippocampal Circuit에서 녹음하기 위한 방법론). J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 유전적으로 변형된 빛에 민감한 인터뉴런을 활성화하여 세타 진동 동기화를 향상시키고 신경 회로 동작을 연구함으로써 광유전학을 사용하여 해마 네트워크 역학을 조절하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 고립된 해마의 광유전학적 조절
   참고: 해마 네트워크 활성의 광유전학적 제어를 위해 PV(파브알부민 양성) 함유 GABAergic 세포의 리듬 활성화를 포함하는 세포 유형 특이적 전략이 여기에 사용되었는데, 이는 이러한 세포가 분리된 해마에서 주요 세포 집단을 동기화하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났기 때문입니다. PV 세포에서 흥분성 채널로돕신-2(ChR2)의 선택적 발현은 PV-Cre 마우스 라인과 ChR2 Cre-의존성(Ai32)을 구성적으로 발현하는 마우스를 교차시켜 PV-ChY 마우스를 생성함으로써 달성됩니다. 또는 바이러스 벡터 구성물(예: AAVdj-ChETA-eYFP)을 PV-Cre 또는 PV-TOM 마우스(P15-16)의 해마에 주입하여 CA1/SUB 중간뉴런에서 흥분성 옵신의 발현을 유도할 수 있습니다(그림 1A).
   1. CA1/SUB(Cornu ammonis-1/subiculum) 영역에 LFP 전극을 배치하고 PV 중간뉴런에서 청색광에 민감한 흥분성 opsin ChR2를 발현하는 마우스의 격리된 해마에 근처의 피라미드 세포를 패치합니다.
   2. 해마 준비물 위에 광섬유 광 가이드(직경 0.2 - 1mm)를 놓고 기록된 영역의 중앙에 놓습니다. 광유전학적 자극을 위해 광 펄스(10 - 20ms, 트랜지스터-트랜지스터 논리 신호에 의해 트리거됨) 또는 세타 주파수(4 - 12Hz)에서 전달되는 사인파 전압 명령으로 구성된 LED 소스의 청색광(473nm)을 사용합니다.
   3. 전류 클램프로 전환하고 자발적인 세타 진동 동안 피라미드의 활동을 특성화합니다.
   4. 자극 프로토콜을 시작하고 광 반응을 기록합니다. 기록된 뉴런의 자기장 진동과 시냅스 활성이 광유전학적 자극 중에 점점 더 동기화되고 PV 세포의 리드미컬한 페이싱이 세타 진동의 주파수와 전력 모두를 강력하게 제어하는 결과를 관찰합니다(그림 1).

결과

그림 1: 고립된 해마에서 자발적 및 광유전학적으로 구동되는 세타 진동 동안 단일 CA1/SUB 피라미드 및 PV 뉴런의 국소 자기장 전위 및 동시 패치 클램프 기록.

(a) 청색광에 민감한 옵신(ChETA와 형광단 eYFP와 결합)을 발현하는 CA1/SUB 영역 위에 광섬유 가이드를 배치하여 LFP 및 패치 전극 기록 부위를 보여주는 다이어그램. (b) 기록된 세포의 전형적인 RS(Regular-Spik) 특성(위) 및 고배율(40X) 이미지를 보여주는 피라미드 뉴런의 특성화(아래). (c) LFP 신호(회색)와 함께 탈분극된 막 전위(검은색)에서 동일한 셀의 샘플 전류 클램프 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
소금	시그마 알드리치	S9625
자당	시그마 알드리치	S9378 (영어
중탄산나트륨	시그마 알드리치	S5761
NaH2PO4 - 인산나트륨 일염기성	시그마 알드리치	S8282 (영어
황산마그네슘	시그마 알드리치	M7506
염화칼륨	시그마 알드리치	P3911
D-(+)-포도당	시그마 알드리치	G7528 (영문
염화칼슘 이수화물	시그마 알드리치	C5080
아스코르브산나트륨	시그마 알드리치	A7631-25G
설비
95% O2/5% CO2 혼합 가스(발화원)	바이탈레어	SG466204A	관류 시스템
유리병/플라스크(4 x 1L)	북미	북미	관류 시스템
수중 녹음 챔버	맞춤형 디자인(FM)	북미	상업적 대안을 사용할 수 있습니다.
멀티 클램프 700B 패치 클램프 증폭기	분자 장치	멀티클램프	전기생리학
멀티클램프 700B 커맨더 프로그램	분자 장치	멀티클램프	전기생리학
디지털/아날로그 컨버터	분자 장치	디디440	전기생리학
Micromanipulators (수동 작동)	시스키유	MX130	전기생리학(LFP)
Micromanipulators (자동)	시스키유	MC1000e	전기생리학(패치)
오디오 모니터	A-M 시스템	모델 3300	전기생리학
맞춤형 정립 형광 현미경	시스키유	북미	이미징
아날로그 비디오 카메라	코후	4912-2000/0000	이미징
이미징 소프트웨어가 있는 디지털 프레임 그래버	주식회사 에픽스	PIXCI-SV7	이미징
Olympus 2.5x 대물렌즈	올림푸스	MPLFLN	이미징
Olympus 40x 침수 대물렌즈	올림푸스	UIS2 럼플플른	이미징
맞춤형 발광 다이오드(LED) 시스템	관습	북미	광유전학적 자극 (Amhilon et al., 2015)
마리
PV::Cre (KI) 마우스	잭슨 연구소	재고 번호 008069	PV 인터뉴런에서 Cre 지시 유전자 발현 허용
구성-조건부 Ai9 마우스(R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	잭슨 연구소	재고 번호 007905	Cre 매개 재조합 후 TdTomato 표현
Ai32 마우스 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	잭슨 연구소	재고 번호 012569	Cre 재조합효소에 노출된 후 개선된 channelrhodopsin-2/EYFP 융합 단백질 발현
PVChY 마우스	사육	북미	PV-Cre 계통을 Ai32 마우스(R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP)와 교배하여 얻은 자손

) ) (영문) ) 시리즈