방법 논문

동시 광 자극 및 비디오 녹화를 통한 기능적 신경근 접합부 평가

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Liberman, M., et al., Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. 특급. (2022).

이 동영상은 기능적 신경근 접합부를 평가하는 방법을 보여줍니다. 근육 조직과 운동 뉴런을 포함하는 생물반응기와 형광 현미경을 사용하여 뉴런의 빛에 민감한 채널을 자극하여 전기 신호를 생성하여 근섬유 수축을 일으킵니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 생물 반응기 준비

  1. 생물 반응기 금형 만들기
    1. 보충 CAD 파일에서 생물반응기 CAD(Computer-Aided Design) 파일을 다운로드하거나 사용자 정의 설계를 작성합니다.
    2. CAM(Computer-Aided Manufacturing) 소프트웨어를 사용하여 3D 모델에서 CNC(Computer Numerical Control) 공구 경로를 생성합니다.
    3. CNC 밀링 머신을 사용하여 아세탈 금형을 가공합니다.
  2. 생물반응기 제작
    1. 폴리디메틸실록산(PDMS, 4개의 플랫폼/금형당 77g의 혼합물)과 10:1 염기를 혼합합니다.
    2. 혼합물을 진공 챔버에 넣고 모든 밸브를 닫고 진공 청소기를 켜고 기포가 남지 않을 때까지 최소 30분 동안 혼합물의 가스를 제거합니다. 혼합물을 금형에 붓고 1시간 동안 진공 챔버에서 금형의 가스를 제거합니다.
    3. 금형의 위쪽 절반이 올바른 방향으로 있는 금형을 닫습니다. 중앙에 강철 육각 막대를 놓고 양쪽에 고정합니다.
    4. 상단을 PDMS로 다시 채웁니다.
    5. 65°C 오븐에서 최소 4시간 동안 금형을 경화합니다.
    6. 실온으로 냉각한 후 금형에서 플랫폼을 제거합니다.
    7. 1시간 주기의 주방 세제, 400mL의 100% 이소프로판올 및 증류수를 사용하여 초음파 수조에서 장치를 세척합니다.
    8. 65 °C에서 밤새 건조시킵니다.
    9. 유리 커버슬립을 1% 비이온성 계면활성제 폴리올에 30분 동안 담그고 쌓이지 않도록 하여 모두 적절하게 코팅되도록 합니다.
    10. 증류수로 잘 헹구고 65°C에서 밤새 건조시킵니다.
    11. 유리 커버슬립과 PDMS 플랫폼을 1-2분 동안 6L/min의 산소가 공급되는 고온에서 플라즈마 클리너로 처리합니다. 처리가 완료되면 PDMS를 커버슬립에 최소 30초 동안 눌러 둘을 함께 접착합니다.
    12. 세포를 추가하기 전에 접합된 장치를 고압증기멸균합니다.

2. 광 자극 설정 구축

  1. 30mm 케이지 큐브 시스템을 사용하여 중앙에 573nm 이색성 미러를 부착합니다. 빨간색 627nm LED(발광 다이오드)를 594nm 장역 통과 여기 필터와 연결하고 LED가 거울을 향하도록 큐브 상단에 부착합니다. 그런 다음 그림 1A의 회로도와 같이 LED가 미러를 향하도록 546nm 단역 통과 여기 필터가 있는 파란색 488nm LED를 큐브의 인접 면에 연결합니다.
  2. 케이지 큐브의 바닥에 링 작동식 조리개를 부착하여 조명이 켜진 영역의 크기를 제어합니다.
  3. T-Cube LED 드라이버로 각 LED에 전원을 공급하고 Arduino Uno Rev3 보드를 통해 제어합니다. LED 드라이버의 측면 입력을 전원 플러그에 연결하고, 중간 출력을 Arduino에 연결하고, 측면 출력을 LED에 직접 연결합니다.
  4. USB 케이블로 Arduino Uno를 컴퓨터에 연결합니다.
  5. GitHub 링크(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)에서 파일을 다운로드합니다.
  6. GitHub 폴더에서 "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" 파일을 엽니다.
  7. 시작 매개 변수 설정: Steps = 30; startFrequency = 0.5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
  8. 핀 출력 4가 파란색 LED 드라이버에 할당되고 핀 출력 2가 빨간색 LED 드라이버에 할당되었는지 확인합니다. LED 드라이버의 중간 와이어가 접지 및 해당 핀 출력에 연결되어 있는지 확인하십시오.
  9. "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" 프로그램을 컴파일하고 Arduino에 로드합니다.
  10. 각 LED 드라이버를 해당 채널에 연결합니다.

3. 세포 배양 설정 (-21-0일차)

  1. 1차 골격근 세포
    1. Myotonic 성장 배지(+ 보충제)를 사용하여 최대 6개의 계대까지 1차 골격 근아세포(Cook Myosite에서 얻음)를 해동 및 확장합니다. 37°C 및 5% CO2로 설정된 인큐베이터에서 세포를 유지합니다.
    2. 2일마다 미디어를 교체하십시오.
    3. 세포가 약 60% 밀집되면 0.05% Trypsin-EDTA(1x, 37°C에서 5분 동안)를 사용하여 세포를 통과시킵니다. 해리된 세포를 모으고 새로운 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.
    4. 300 x g에서 세포를 스핀다운하고 세포 펠릿 위의 상층액을 흡인합니다.
    5. MGM으로 세포를 재현탁시키고 3중 플라스크당 60mL로 1:3 시드
      6. 를 투여합니다.
  2. ChR2-hiPSC
    메모: 이 연구를 위한 모든 세포주는 미국 뉴욕주 컬럼비아 대학의 기관 가이드라인에 따라 생성 및 사용되었습니다. 이 프로토콜에서 ChR2 발현 hiPSC는 앞서 설명한 방법을 사용하여 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 통해 생성되었지만18 안정적인 광유전학적 세포주(lentiviral, piggyBac 등)는 동일한 방식으로 사용할 수 있습니다. iPSC와 운동뉴런 모두에서 발현되는 구성적 프로모터(constitutive promoter)를 선택했습니다(CAG). 이 세포는 이전 간행물에서 언급했듯이 건강한 핵형을 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다.
    1. 6-well 플레이트를 DMEM/F12(1:80)로 희석된 1mL/웰의 solubilized basement membrane matrix로 코팅하고 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.
    2. 2mL의 무공급 세포 배양 배지(iPSC 배지)가 포함된 코팅된 6웰 플레이트에 iPSC를 시딩하고, 격일로 2mL의 배지를 교환하고 5-7일마다 통과시킵니다. 37°C 및 5% CO2로 설정된 인큐베이터에서 세포를 유지합니다.
    3. 패시징
      1. 줄기세포를 1mL의 무효소 줄기세포 방출 시약으로 4분 동안 배양하고 팁이 넓은 P1000 피펫으로 기계적으로 전단하여 줄기세포를 해리합니다.
      2. 코팅된 6-웰 플레이트에 2 mL/웰 내 2 μM의 Y-27632 디하이드로클로라이드와 함께 iPSC 배지에서 1:24 또는 1:48 비율로 시드 세포.

4. 골격근 조직 파종(-3일차)

  1. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 30 x 106 myoblast를 분리하고 계수합니다.
  2. 3mg/mL 콜라겐 I과 가용화된 기저막 매트릭스(800μL의 콜라겐 혼합물 + 200μL의 기저막 매트릭스를 4:1로 혼합하여 1mL의 최종 부피에 도달)의 4:1 혼합물로 근아세포를 재현탁합니다. 콜라겐 성분의 경우 동반 중화제(콜라겐과 중화제의 9:1 혼합)를 추가하고 혼합물을 1x PBS로 희석하여 800μL의 부피를 얻습니다.
  3. 생물반응기의 각 근육실에 15μL의 세포-콜라겐 현탁액을 추가하고 피펫 팁을 사용하여 두 기둥에 현탁액을 펴 놓습니다(그림 2).
  4. 세포-겔 혼합물을 37°C에서 30분 동안 중합시킨 다음 각 생물반응기에 450μL의 근육성 성장 배지를 채웁니다.
  5. 3일 후(겔이 굳어지면) 근관 분화를 시작합니다.

5. 근관 분화(0-14일)

  1. 7일 동안 조직을 450μL의 융합 유도 배지(FS, 표 1)로 전환하고 격일로 배지를 교체하여 근관 주입을 시작합니다.
    메모: 두 세포 유형의 분화 일정이 끝날 때 운동뉴런을 시드하기 위해 hiPSC에서 운동뉴런 분화와 같은 날에 근튜브 분화를 시작하십시오.
  2. 7일차에 배지를 450μL의 성숙 배지 Ia로 변경합니다(MMIa, 표 1).
  3. 9일째에 450μL의 성숙 배지 Ib로 변경합니다(MMIb, 표 1).
  4. 11일차에 배지를 450μL의 NbActiv4로 변경합니다. 운동 뉴런이 시드될 때까지 2일마다 배지를 계속 교체합니다(7단계).

6. 운동 뉴런 분화 (0-14 일)

  1. 0일차에 4 x 106 ChR2-hiPSC를 15mL의 모토뉴런 현탁 배양 배지(MSCM, 표 1)가 있는 초저 부착 페트리 접시로 옮깁니다. MSCM에 3μM CHIR99021, 0.2μM LDN193189, 40μM SB431542 수화물 및 5μM Y-27632 이염산
    2. 염을 보충합니다.
  2. 2일차에는 37μM 가역적 스트레이너로 신경구(NS)를 분리하고 3μM CHIR99021, 0.2μM LDN193189, 40μM SB431542 수화물 및 0.1μM 레티노산이 포함된 15mL의 MSCM을 다시 플레이팅합니다. 2일차 이후에는 현미경을 사용하지 않고도 페트리 접시에서 NS를 볼 수 있어야 합니다.
  3. 4일차에 세포와 배지를 50mL 튜브로 옮기고 신경구가 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다(5분). 상등액을 흡인하고 0.5μM SAG, 0.2μM LDN193189, 40μM SB431541 및 0.1μM 레티노산이 보충된 15mL의 MSCM에 세포를 재현탁합니다.
  4. 7일째에 6.3단계를 반복하되 0.5μM SAG 및 0.1μM 레티노산이 보충된 15mL의 MSCM에 세포를 재현탁합니다.
  5. 9일째에 6.3단계를 반복하되 10μM DAPT가 보충된 15mL의 MSCM에서 세포를 재현탁합니다.
  6. 11일째에 6.3단계를 반복하되 20ng/mL BDNF 및 10ng/mL GDNF가 보충된 15mL의 MSCM에 세포를 재현탁합니다.
  7. 14일째에 운동 뉴런을 플랫폼에 시드합니다.

7. 생물 반응기에서 운동 뉴런 응집체 파종 (14 일차)

  1. 2mg/mL 콜라겐 I과 Matrigel(콜라겐 혼합물 800μL + Matrigel 200μL로 최종 부피 1mL에 도달)의 4:1 젤 혼합물을 준비합니다. 콜라겐 성분의 경우 동반되는 중화제(콜라겐과 중화제의 9:1 혼합)를 추가하고 혼합물을 1x PBS로 희석하여 최종 부피 800μL를 얻습니다.
  2. 400nm 세포 스트레이너를 사용하여 큰 신경구를 선택하고 겔 혼합물에 재현탁합니다.
  3. 저장소에서 배지를 흡인하고 신경구 우물에서 조심스럽게 흡입합니다(그림 2).
  4. 15μL의 겔 혼합물을 신경구 채널에 추가합니다.
  5. 10μL 피펫에 10μL의 겔을 로드한 다음 하나의 신경구를 선택합니다.
  6. NS를 신경구 채널에 넣고 NS가 챔버에 있는지 확인합니다. NS가 침착되면 나머지 겔을 방출하면서 피펫을 천천히 올립니다. NS가 올바르게 입금되었는지 확실하지 않은 경우 현미경을 사용하여 위치를 확인하십시오.
  7. 겔이 37 °C에서 30 분 동안 중합되도록합니다.
  8. 리저버에 20ng/mL BDNF 및 10ng/mL GDNF가 보충된 450μL의 NbActiv4를 추가합니다.
  9. NS에서 근육 조직으로 축삭이 성장할 수 있도록 격일로 배지를 교체하십시오.

8. NMJ 기능의 동시 광학 자극 및 비디오 녹화(24+일차)

  1. 이미징을 위해 과학적 sCMOS(Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) 카메라와 함께 도립 형광 현미경을 사용하십시오.
  2. 카메라 소프트웨어 binning을 2x2로, 노출을 20ms로, 롤링 셔터를 켜고, 판독 속도를 540MHz로, 동적 범위: 12비트 및 게인 1, 센서 모드: 오버랩으로 설정합니다.
  3. 현미경의 2x 대물렌즈를 사용하여 미세조직을 이미지화합니다.
  4. 현미경 스테이지에 라이브 셀 챔버(37 °C, 5% CO2)를 부착합니다.
  5. 신경 분포된 골격 조직 조직을 포함하는 관심 영역(ROI)을 선택하여 파일 크기와 처리 시간을 최소화합니다.
  6. 샘플과 이미징 대물렌즈 사이에 594nm 장역 통과 방출 필터를 배치하여 카메라에서 청색광 펄스를 필터링합니다.
  7. 4개의 바이오리액터(24개 조직)가 포함된 직사각형 4웰 플레이트를 라이브 셀 챔버에 놓습니다.
  8. 라이브 뷰를 클릭합니다. 원하는 ROI로 이미지의 중심을 잡고 초점을 맞춥니다.
  9. GitHub 폴더(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)에서 사용자 지정 매크로 코드를 업로드하여 스테이지 위치, Arduino 보드 및 비디오 획득을 제어합니다.
  10. 출력 동영상을 day_tissue group_tissue name_experiment.nd2로 설정합니다.
  11. 스테이지에 설정된 원하는 X,Y 좌표로 매크로 코드를 실행하고 50프레임/초에서 1700프레임으로 빠른 타임랩스를 획득합니다.
  12. 이미징 후 미디어를 교체하고 샘플을 인큐베이터로 반환합니다. 조직 피로를 피하기 위해 이미지 획득 세션 사이에 최소 24시간을 허용합니다.

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결과

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figure-results-1
그림 1. NMJ 기능의 자극, 기록 및 분석. (A) LED 설정 및 광 경로의 개략도. (B) 도립 현미경, 라이브 셀 챔버, 자동 스테이지 및 sCMOS 카메라를 사용한 광학 설정. (C) NMJ 배양의 광학 자극 비디오의 일괄 처리를 위한 알고리즘. (D) MATLAB 코드에 의해 생성된 비디오의 대표 프레임과 해당 수축성 추적 그래프. 비디오에서 깜박이는 파란색 상자와 그래프의 세로선은 파란색 광 자극이 발생하는 시점을 나타냅니다.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
셀
증권 시세쿡 묘사이트P01059-14엠
미디어 및 보충제
고급 DMEM/F12써모피셔 사이언티픽제12634-020
소 세럼 알부민 솔루션밀리포어 시그마A9576-50ML
G-5 보충제 (100X)써모피셔 사이언티픽17503-012
유전 선택적 항생제(G418 황산염)(50mg/mL)써모피셔 사이언티픽제10131-035
인슐린, 재조합 인간밀리포어 시그마91077C-100MG
마트리겔코 닝354277
mTeSR 플러스줄기세포 기술제100-0276
MyoTonic 성장 미디어 키트쿡 묘사이트재질 보기 MK-4444
N-2 보충제써모피셔 사이언티픽제17502-048
NBactiv4 500 mL브레인비츠 LLCNB4-500
Neurobasal 배지써모피셔 사이언티픽제21103-049
Neurobasal-A 배지써모피셔 사이언티픽A13710-01
플루로닉 F-127시그마 알드리치P2443
ReLeSR줄기세포 기술5872
플라스틱 그릇
30mm 케이지 큐브 시스템토르랩스CM1-DCH, CP33, ER1-P4 및 ER2-P4
37 μm 리버시블 스트레이너, 대형줄기세포 기술27250
546nm 단역 통과 여기 필터셈록FF01-546/SP-25
573 nm 이색성 미러셈록FF573-Di01-25x36
594nm 장역 통과 방출 필터셈록BLP01-594R-25
594nm 장역 통과 여기 필터셈록BLP01-594R-25
SinkPAD-II 10mm 정사각형 베이스의 파란색(470nm) 반란군 LED - 65lm @ 700mA럭시온스타LEDSP-05-B4
Carclo 29.8° 프로스트 10mm 원형 빔 광학 장치 - 통합 다리럭시온스타LED10413
코닝 60mm 초저 부착 배양 접시코 닝3261
방열판럭시온스타LEDLPD-19-10B
광학
pluriStrainer 400 μm, 25팩, 멸균플루리셀렉트Tel.: 43-50400-03
pluriStrainer 500 μm, 25 팩, 멸균플루리셀렉트Tel.: 43-50500-03
SinkPAD-II 10mm 정사각형 베이스의 빨간색(627nm) 반란군 LED - 65lm @ 700mA럭시온스타LEDSP-05-R5
링 작동식 아이리스 다이어프램토르랩스SM1D12D
T-Cube LED 드라이버토르랩스LED1B, KPS101
금형
암 나사산 육각 스탠드오프, 3 1/2" 10-32, 부분 나사산 1/2"맥마스터91920A046
로우 프로파일 C-클램프맥마스터1705A12
성장 인자
아데노신 3", 5"-고리형 일인산염밀리포어 시그마A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg토크리스4423-10
DAPT 10 밀리그램R&D 시스템2634-10
인간 CNTF, 연구 등급, 5 μg밀테닐 바이오텍Tel.: 130-096-336
인간 비트로넥틴 단백질, CFR&D 시스템2349-VN-100
인간 비트로넥틴 단백질, CFR&D 시스템2349-VN-100
IGF1 재조합 인간 단백질써모피셔 사이언티픽PHG0078
라미닌 마우스 단백질, 천연써모피셔 사이언티픽23017015
재조합 인간 아그린 단백질R&D 시스템6624-AG-050
재조합 인간 GDNF 단백질, CF 50ugR&D 시스템212-GD-050/CF
재조합 인간 Neurotrophin 3 100 ug세포 과학CRN500D
재조합 인간 Neurotrophin-4세포 과학CRN501B
재조합 인간 음파 고슴도치/SHH (C24II) N-TerminusR&D 시스템1845-SH-100
재조합 인간/쥐/쥐 BDNF 50 ug페프로텍450-02
레티노산, 50mg밀리포어 시그마R2625-50
SAG 스무드 아고니스트밀리포어 시그마566660
SB431542 10 mg줄기세포 기술72234
스템맥스 LDN-193189밀테닐 바이오텍Tel.: 130-103-925
인간 혈장에서 추출한 비트로넥틴밀리포어 시그마V8379-50UG
Y-27632 이염산염토크리스1254
항 체
α-actinin mAb(마우스 IgG1)아브캠AB9465
콜린 아세틸전이효소(ChAT)(염소)밀리포어AB144P
Desmin mAb (마우스 IgG1)다코M076029-2
미오신 중쇄(MHC) (마우스 IgG2b)증권 시세MF20
설비
아두이노 우노 R3아두이노A000066
자동화된 스테이지응용 과학 계측 기기MS- 2000 XYZ
확장된 플라즈마 클리너해릭 플라즈마PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess 자동 세포 계수기마샬 사이언티픽CACC
IX-81 도립 형광 현미경올림푸스IX-ILL100LH
시리즈 스테이지 탑 인큐베이터 시스템토카이 히트 STX토카이 히트 - STXG
Zyla 4.2 sCOMS 카메라안도르 테크놀로지자일라-4.2P-CL10
소프트웨어
아두이노 소프트웨어(IDE)아두이노IDE 1.8.19
마스터캠마스터캠Solidworks용 Mastercam
매트랩매트랩R2021b를 참조하십시오.
NIS 요소니콘기초 연구
솔리드웍스 3D CAD솔리드웍솔리드 웍스 스탠다드
표시기 호 년 호 호 호 (영문) 호 년 년 년 년 시리즈 년 년 년 년 시리즈 년 표시기 인증 스

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