신경 세포에서 단백질 추출

초록

출처: Shani, T., et al. 운동 뉴런 유사 NSC-34 세포 내에서 실시간으로 핵세포질 수송을 측정하기 위한 분석법. J. Vis. 특급 (2017년)

이 프로토콜은 신경암 세포에서 단백질을 추출하는 방법을 설명합니다. 세포는 완충액으로 세척되고 효소 및 기계적 파괴를 통해 용해됩니다. 추출된 단백질이 풍부한 상등액은 원심분리 후 회수됩니다.

프로토콜

1. 세포주 준비

1. 액체 질소 용기에 저장된 약 1,000,000개의 마우스 신경모세포종 척수 세포(NSC-34 세포)를 해동합니다. 세포가 완전히 해동될 때까지 37°C 물 인큐베이터를 사용하십시오.
2. 신선하고 따뜻한 배지(10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민 및 1% 펜 연쇄상구균 항생제를 함유한 DMEM 배지)를 추가합니다.
3. 세포(SL16R)를 500 x g에서 5분 동안 원심분리기로 해동하여 세포 펠릿을 형성합니다. 배지를 버리고 세포 재현탁을 위해 1mL의 새 배지를 추가합니다.
4. 재현탁 세포를 15mL 플라스크에 넣고 5mL의 배지를 추가로 추가합니다. 37°C에서 5% CO₂가 포함된 멸균 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.
5. 동시에 8mm 배양 접시에 코팅되지 않은 커버 슬립 8개(커버 유리: 0.13-0.17mm 두께)를 60mm 배양 접시에 넣고 70% 에탄올을 사용하여 건조될 때까지 30분 동안 자외선에 노출시켜 살균합니다. 각 접시에 매체를 넣고 잔류 에탄올을 씻어내도록 처분하십시오.
6. 약 90% confluence(플라스크당 약 600만 개의 세포)에 도달한 세포에 트립신 완충액(Hanks' Balanced Salt Solution 1L에 트립신 2.5g 및 EDTA 0.2g)을 추가하여 부착 세포가 해리될 수 있도록 합니다.
   참고: NSC-34 세포는 민감하며 배지를 사용하여 해리하기 전에 15초의 트립신 완충액 배양과 1분의 추가 트립신 무배양만 필요합니다.
7. 커버슬립이 이미 들어 있는 60mm 배양 접시에 접시당 약 350,000개의 배지 3mL를 플레이트로 만듭니다. 커버슬립에 세포가 부착될 수 있도록 인큐베이터에 24시간 동안 그대로 두십시오.

2. 단백질 발현 검증

1. 각 실험 그룹의 잔여 세포(위 실험에서는 사용되지 않음)가 들어 있는 60mm 배양 접시를 얼음 위에 놓습니다.
2. 배지를 폐기하고 PBS로 세포를 두 번 세척하여 나머지 배지를 희석하고 세척합니다.
3. PBS, 0.5% Triton 및 프로테아제 억제제 칵테일 정제(PI)를 함유한 200-400μL의 용해 완충액으로 세포를 처리합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 긁습니다.
4. 마이크로 원심분리기 튜브의 용해 완충액에 있는 세포를 수집하고 얼음 아래에서 1분 동안 4,000rpm에서 균질화기로 균질화합니다.
5. 균질화된 세포를 2,500 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 수집하고, Bradford 분석을 사용하여 단백질 농도를 정량화하고, 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
6. 총 단백질(단백질에 따라 다름)을 30-70μg으로 수집하고 SDS-PAGE 겔에 로드하여 면역블롯 분석을 사용하여 단백질 발현을 테스트합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마우스 운동 뉴런 유사 하이브리드 세포주(NSC-34)	테부바이오	클루140-A
DMEM 4.5g/L L-포도당	생물 산업	01-055-1ᄀ
FBS 유럽 등급	생물 산업	04-007-1ᄀ
SL 16R 원심분리기	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	75004030
Thermo Forma Series ii 워터 재킷 CO2 인큐베이터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	3111
커버 유리 직경 12mm 두께 0.13-0.17mm	바 Naor LTD
Axiovert 100 도립 현미경	자이스
렙토마이신 B	시그마	L2913
PBS (PBS)	생물 산업	02-023-1ᄀ
균질화기 모터/제어/척/90도 클램프	글라스 콜	099C K5424CE
MicroCL 17R 원심분리기, 냉장	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	75002455